中文摘要
目的研究乙型脑炎减毒活疫苗在动物皮下接种后的毒性反应和全身主动过敏反应，考察疫苗安全性。
方法采用Sprague-Dawley大鼠皮下注射单次给药毒性试验评价疫苗的急性毒性；采用豚鼠全身主动过敏试验评价疫苗的致敏性。
结果乙型脑炎减毒活疫苗以1.50 mL/只的剂量单次皮下注射给予大鼠，未见与供试品相关的毒性反应，最大耐受量为1.50 mL/只。乙型脑炎减毒活疫苗分别以0.05 mL/只（低剂量）和0.50 mL/只（高剂量）皮下注射致敏3次，并在末次致敏后14 d以0.10 mL/只（低剂量）和1.00 mL/只（高剂量）静脉注射激发，可导致豚鼠发生全身主动过敏反应。
结论乙型脑炎减毒活疫苗在动物皮下接种后，毒性反应和全身主动过敏反应符合动物安全性评价要求。
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正文
流行性乙型脑炎（乙脑）是由乙脑病毒引起的中枢神经系统急性传染病。感染乙脑病毒的病例中至少有30％的患者会出现永久性的神经系统后遗症，尚无特异性有效疗法，预防和控制乙脑传播的最有效、最经济的手段是接种乙脑疫苗。
Sprague-Dawley（SD）大鼠和豚鼠是目前普遍用于人用药物毒理学研究的啮齿类动物，二者对外源性物质较敏感，是相关供试品在动物致敏性研究中的首选动物模型。武汉生物制品研究所有限责任公司（武汉公司）为了进一步提高乙脑减毒活疫苗的稳定性，进行了疫苗冻干稳定剂处方变更，与昭衍（苏州）新药研究中心有限公司一起开展了乙脑减毒活疫苗在SD大鼠中的急性毒性试验及在豚鼠中的全身主动过敏试验，旨在评价乙脑减毒活疫苗的非临床安全性。
1
材料与方法
1.1
供试品
供试品1：乙脑减毒活疫苗（批号：Y201905002-1）由武汉公司研制，冻干粉针剂，复溶后每瓶0.5 mL，包括乙脑病毒、明胶、蔗糖、乳糖、尿素、人血白蛋白等有效成分；供试品2：无人血白蛋白乙脑减毒活疫苗（批号：S202007001）由武汉公司自制，有效成分包括乙脑病毒、明胶、蔗糖、乳糖、尿素。
1.2
实验动物
无特定病原体（specific pathogen free， SPF）级SD大鼠，订购24只，实际使用20只，雌雄各半，6~8周龄，雄性大鼠体重为220~240 g，雌性大鼠体重为187~226 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0001，动物质量合格证编号：雌性110011200105485365、雄性110011200105485278。
SPF级Hartley豚鼠，订购54只，实际使用49只，雄性，4~6周龄，体重为255~294 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，动物质量合格证编号：110011200105690358。
1.3
主要试剂及仪器
人血白蛋白购自四川远大蜀阳药业有限责任公司，氯化钠注射液购自湖南科伦制药有限公司，灭菌注射用水购自安徽双鹤药业有限责任公司。YP10001电子天平购自常州市宏衡电子仪器厂，ABS小动物气体麻醉机购自上海玉研科学仪器有限公司，BCD-215KAN DZ冰箱购自青岛海尔股份有限公司。
1.4
大鼠急性毒性试验
根据给药前1 d测定的大鼠体重，将20只SD大鼠用计算机系统按性别区段随机分配为阴性对照组和供试品组，每组10只，阴性对照组大鼠雄性编号为2035381—2035385，雌性编号为2035386—2035390；供试品组大鼠雄性编号为2035391—2035395，雌性编号为2035396—2035400。根据疫苗信息及相关指导原则，阴性对照组大鼠每只单次皮下注射1.50 mL氯化钠注射液，供试品组大鼠每只单次皮下注射3剂乙脑减毒活疫苗（供试品1），即1.50 mL。给药当天定义为第1天，第1天给药后连续肉眼观察约4 h，观察内容包括行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足、呼吸等；给药第2天至第15天，每天上下午对大鼠各进行临床观察1次，观察内容包括死亡、发病、呼吸、分泌物、粪便情况等；每周1次从饲养笼中取出做详细临床观察，内容包括但不限于行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足、呼吸等，每周定期对体质量和摄食量进行检测。第15天观察期结束后，将所有大鼠实施安乐死，进行大体解剖观察。
1.5
豚鼠全身主动过敏试验
根据相关指导原则要求，致敏选择皮下注射，为临床拟用途径；激发选择能使抗原大量快速进入血液的途径，即静脉注射。在给药前2 d对豚鼠进行体重检测，将体重相近的豚鼠使用计算机系统随机分为5组，分组后豚鼠的组别、注射方式和成分、编号详情以及各组豚鼠给药剂量和给药容量见表1。5组豚鼠致敏3次，分别为第1、3、5天，于末次致敏后14 d，对每组前3只豚鼠进行足部静脉注射激发，若激发后供试品组出现过敏反应症状，于当天对每组剩余的豚鼠进行激发，静脉注射激发后连续观察30 min，记录每只豚鼠出现的过敏反应症状，判断过敏反应程度，并依据豚鼠致敏性评价参照表（表2），综合分析豚鼠的过敏性结果。另取编号为46—49的4只未致敏的豚鼠，其中2只按低剂量组激发量每只静脉注射0.10 mL供试品1，另外2只按高剂量组激发量每只静脉注射1.00 mL供试品1。
1.6
统计学分析
应用Excel 2016软件记录实验数据，应用Provantis 9.4.3.0软件在实验中对大鼠和豚鼠进行随机分组，并计算大鼠和豚鼠实验期间的体重和摄食量的均值、标准差。
2
结果
2.1
大鼠的急性毒性试验
给药当天及给药第2天至第15天，所有大鼠的行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足、呼吸等均未出现异常变化，所有大鼠的体重均呈增长趋势，统计数据见表3；所有大鼠的体重及摄食量均未出现异常改变，15 d内大鼠未出现发病和死亡情况。第15天观察期结束后，将所有大鼠实施安乐死并进行大体解剖，由于局部观察均未见异常改变，因此未进行组织病理学检查，动物尸体按医疗废弃物处理。
2.2
豚鼠的主动过敏试验
所有豚鼠激发前临床观察均未见异常反应，足部静脉激发后，阴性对照组9只动物均未见过敏反应症状，过敏反应呈阴性；阳性对照组9只动物出现不同程度的过敏反应症状，其中1只动物死亡，过敏反应呈强阳性至极强阳性；供试品1低剂量组9只动物出现不同程度的过敏反应症状，其中1只动物死亡，过敏反应呈弱阳性至极强阳性；供试品1高剂量组9只动物出现不同程度的过敏反应症状，其中3只动物死亡，过敏反应呈弱阳性至极强阳性；供试品2即无人血白蛋白对照组9只动物未出现过敏反应症状，过敏反应呈阴性，各组动物静脉给药激发后的过敏性反应结果详见表4。
另外，因首次激发注射后，供试品1低、高剂量组均有动物出现过敏反应症状，故取其余4只未致敏豚鼠（编号46—49）分别按照低、高剂量组激发量静脉注射供试品1，结果未观察到类似过敏反应症状。由于无人血白蛋白对照组动物同样接受高剂量皮下致敏，激发后均未见过敏反应症状，因此供试品组豚鼠发生全身主动过敏反应可能为人血白蛋白致敏和激发导致，而不是由乙脑病毒、明胶、蔗糖、乳糖、尿素等成分导致。
3
本研究对乙脑减毒活疫苗的急性毒性进行了系统的评估，旨在为疫苗的安全性和有效性提供科学依据。在本研究条件下，乙脑减毒活疫苗以1.50 mL/只的剂量单次皮下注射给予SD大鼠，未见与供试品相关的毒性反应，最大耐受量为1.50 mL/只，注射疫苗后大鼠无不良反应，体重增加正常，表明疫苗在大鼠体内安全性良好。急性毒性研究实验动物未出现明显的行为异常、体重减轻或死亡等毒性表现。
由于供试品中含有稳定剂人血白蛋白，为已知的致敏阳性物质，因此设置了无人血白蛋白对照组。结果显示，末次致敏后14 d激发供试品低、高剂量组动物均可见全身主动过敏反应；补充试验4只豚鼠未致敏、只激发，未观察到类似过敏反应症状；皮下注射致敏后无人血白蛋白的供试品足部静脉激发未出现主动过敏反应症状，这与其他含有人血白蛋白的疫苗主动过敏试验研究结果一致。综上，对药物的临床前过敏性评价，应针对药物的不同特点合理地进行实验设计。此外，供试品的临床拟用剂量为0.50 mL/剂，本研究致敏时供试品低剂量和高剂量分别约为临床拟用剂量的20倍和200倍（豚鼠以300 g计算，人以60 kg计算），由于豚鼠主动过敏试验仅是对动物行为学指标进行观察，在临床用药中，人血白蛋白为人体同种蛋白，在临床使用中产生过敏反应的风险可能性较低，且乙脑减毒活疫苗采用上臂外侧三角肌下缘附着处皮下注射，因此豚鼠全身主动过敏试验临床前过敏性评价不适宜直接外推到人，对临床的指导价值有限，仅提示临床研究中需关注过敏反应的发生。
综上所述，武汉公司研制的乙脑减毒活疫苗的急性毒性、主动过敏试验符合动物安全性评价要求。
作者
祁春华1 乔建1 周兴1 田小凤1 张威1 曾帅1 马春喜2 武传东2
1武汉生物制品研究所有限责任公司乙脑疫苗室， 武汉 430207；2昭衍（苏州）新药研究中心有限公司研发部， 苏州 215421
引用本文：祁春华, 乔建, 周兴等.乙型脑炎减毒活疫苗的动物急性毒性和主动过敏试验 [J].国际生物制品学杂志, 2025, 48(1): 16-19.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240429-00023
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撰写| 国际生物制品学杂志
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice
