撰文 | 咸姐
在人类健康领域，结直肠癌（CRC） 一直是一个备受关注的重要课题。作为一种常见的恶性肿瘤，它对全球公共卫生构成了重大威胁。结直肠癌的发生并非偶然，其背后隐藏着复杂的生物学机制，其中基因突变扮演着关键角色。毫不夸张的说，CRC是突变在人类癌症中发挥作用的一个典型范例，而导致CRC的致癌突变可以长期存在于健康的肠道中而没有明显的后果。在正常人体肠道中，存在着一种名为结肠腺瘤样息肉（Adenomatous polyposis coli,Apc） 的基因，它在维持肠道生理功能和细胞正常生长中发挥着重要作用。然而，当Apc基因发生突变时，情况便急转直下。这种突变激活了Wnt信号通路，使得肠道干细胞（ISC） 获得了一种异常的生长优势，从而打破了肠道细胞的正常更新平衡【1-3】。尽管Apc突变在肠道中较为常见，但并非所有携带这种突变的细胞都会发展成肿瘤。这一现象显示了一个重要的生物学问题：除了基因突变本身，一定还存在着其他因素在调控肿瘤的发生和发展。这些因素可能与细胞所处的微环境、细胞间的相互作用以及基因表达的调控网络等有关。深入探究这些因素，对于理解结直肠癌的发病机制、寻找有效的预防和治疗方法具有至关重要的意义。
近日，来自美国丹娜-法伯癌症研究所的Ramesh A. Shivdasani团队在Nature上在线发表了文章Crypt density and recruited enhancers underlie intestinal tumour initiation，探索了仅在某些Apc突变细胞中驱动肿瘤发生的可能因素以及表观基因组改变是否在其中起作用，研究结果显示腺瘤的形成并非Apc基因在ISC中缺失的必然结果，相反，邻近突变的肠道隐窝之间的协同作用以及特定增强子的新可及性才是肠道肿瘤发生的早期关键步骤。这项研究不仅颠覆了人们对肠道肿瘤起始的传统认识（更多地关注基因突变本身对肿瘤发生的影响） ，也为开发新的预防和治疗策略提供了重要的理论基础和实验依据。
本文研究人员首先通过构建两种小鼠模型 （ISC-Cre和Sec-Cre） 来对比探究Apc基因缺失后腺瘤形成的差异。ISC-Cre模型通过Lgr5启动子直接标记ISC，而Sec-Cre模型通过Atoh1启动子标记Sec细胞的后代，这些细胞可能通过去分化形成ISC。由于两种来源的ISC无法通过基因表达或开放染色质进行区分，因此这两种小鼠模型可以很好的追踪天然 （ISC-Cre，直接标记） 或去分化 （Sec-Cre，间接标记） ISC的肿瘤发生。利用这两种小鼠模型，研究人员研究了回肠中的肿瘤发生，因为这个部位中两种小鼠品系的标记频率最接近，Apc缺失引发了三种不同的克隆结果：1）“腺瘤”，向肠腔中生长的丰富的畸形上皮；2）在Wnt激活后数月保持稳定的小隐窝囊肿；3）形态正常的隐窝绒毛“带状”（图1）。
图1 小鼠模型示意图
研究人员在两种小鼠模型中诱导Apc基因的特异性敲除 （Apc-/- ISC） ，并通过Rosa26L-S-L-TdTom （R26RTom） 报告基因系统标记Apc突变克隆。研究发现，ISC-Cre小鼠在Apc基因缺失后3周内形成了大量腺瘤，而Sec-Cre小鼠在6周和16周时腺瘤的形成率极低，分别为20%和33%。这表明ISC-Cre小鼠中Apc突变ISC形成腺瘤的能力远高于Sec-Cre小鼠。通过分析，研究人员发现，尽管Sec-Cre小鼠中Apc突变ISC的标记率较低，但这些细胞仍然能通过去分化形成ISC，且标记率随着Apc缺失而增加。然而，这些通过去分化形成的ISC在形成腺瘤方面并不高效。此外，RNA测序结果显示，ISC-Cre小鼠中Apc突变ISC的基因表达谱与腺瘤相关基因高度一致，而Sec-Cre小鼠中的ISC则表现出较低的腺瘤相关基因表达。研究人员还发现，即使APC缺失被克隆固定，也只有部分腺瘤相关转录组被激活，许多APC突变隐窝不会产生腺瘤 （即使在ISC-Cre小鼠中） ，而且在Sec-Cre中，额外的致癌突变也不能实质性地克服其致瘤的限制。
随后，研究人员将ISC-Cre和Sec-Cre小鼠的隐窝分离并培养成类器官，结果显示，两者都能在没有RSPO补充的情况下形成大型球状类器官，这与体内腺瘤的形成形成鲜明对比。尽管体外培养的Apc-/-类器官在转录组水平上表现出与体内Apc-/- ISC相似的基因表达变化，但许多在体外激活的基因在体内并未表现出明显的肿瘤相关变化。这提示，尽管Apc-/- ISC在体外对Wnt激活表现出强烈的转录反应，但在体内环境中，某些细胞外因素必须促进Wnt超活化以实现完全的肿瘤效应。早期X失活谱提示人类结直肠腺瘤是单克隆的，但随后有研究发现人类和小鼠腺瘤是寡克隆的，这提示多个隐窝可能有助于早期肿瘤的发生。本文研究人员利用荧光标记结合蒙特卡洛模拟预测隐窝聚集的频率，发现ISC-Cre小鼠中隐窝的聚集程度远高于随机分布的预期，而Sec-Cre小鼠中隐窝则主要以单个形式存在。通过改变隐窝聚集程度，研究人员还发现，增加隐窝聚集可以促进腺瘤形成，而降低隐窝聚集则显著减少腺瘤的发生，表明相邻突变隐窝之间的协助是启动肿瘤所必需的。
为了识别产生腺瘤和不产生腺瘤的Apc-/- ISC之间的分子差异，研究人员探讨了顺式调控元件是否是导致腺瘤和类器官ISC比分离隐窝中的ISC有更多失调基因的原因。通过ATAC-seq （转座酶可及染色质测序） 技术分析Apc-/- ISC的染色质可及性，研究人员发现与野生型ISC相比，Apc-/- ISC在超过5700个增强子区域显示出新的染色质可及性，这些增强子在野生型ISC中是不活跃的。这些新开放的增强子与Wnt信号通路的TCF/LEF效应因子的DNA结合序列高度相关，并且与Apc-/- ISCs中异常表达的基因密切相关。进一步分析表明，只有约7.35%的新开放增强子在非腺瘤相关的Apc-/- ISC中也表现出可及性，而其余的增强子仅在腺瘤相关的Apc-/- ISC中开放。在ISC-Cre或Sec-Cre小鼠中，那些未能形成腺瘤的稀疏Wnt激活隐窝中，增强子的可及性仅发生了适度改变；而当聚集的隐窝发展成腺瘤时，诱导基因附近的染色质会发生进一步的变化（图2）。此外，研究人员还发现，即使在Apc-/- ISC中引入额外的致癌突变 （如KrasG12D和Trp53缺失） ，增强子的可及性变化也主要发生在Apc丢失后，且这种变化在后续突变中保持稳定。这表明，Apc缺失后的增强子招募是肠道肿瘤早期发生的关键步骤，并且这种表观遗传学变化在肿瘤进展中具有持久性。
图2 研究机制图
综上所述，本研究表明除了已知的基因突变和克隆固定等因素外，Wnt信号激活的隐窝达到一个“临界数量”也是肿瘤发生所必需的。这些隐窝中的染色质在数千个增强子处发生了可及性改变，这种表观遗传学变化与腺瘤的形成密切相关。这些发现为早期肠道肿瘤发生的研究提供了新见解和表观基因组学的相关性证据，增进了我们对肠道肿瘤发生机制的理解，为开发新的预防和治疗策略提供了潜在的靶点。
https://doi.org/10.1038/s41586-024-08573-9
制版人：十一
参考文献
1. Thirlwell, C. et al. Clonality assessment and clonal ordering of individual neoplastic crypts shows polyclonality of colorectal adenomas.Gastroenterology138, 1441-1454 (2010).
2. Powell, S. M. et al. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis.Nature359, 235-237 (1992).
3. Vermeulen, L. et al. Defining stem cell dynamics in models of intestinal tumor initiation.Science342, 995-998 (2013). https://doi.org/10.1126/science.1243148
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