类器官（Organoid）已成为生命科学和医学研究领域的“明星模型”，在疾病机制研究、药物筛选、精准医疗等方面展现出巨大潜力。然而，许多科研人员在尝试类器官培养时，常常面临“无法形成结构”、“细胞活性低”、“传代失败”等问题。
探究其根本，培养体系中细胞因子的选择和配比可能是成败的关键！
接下来，我们将会结合类器官经典培养方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins），解析“四大护法”如何各显神通，助你攻克类器官培养难关！
类器官的经典培养方案WENR（或称为WNER）最初由类器官之父、荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers教授团队开发，其核心成分包括 Wnt-3a、EGF、Noggin 和 R-Spondins，常被称为类器官培养的“四大护法”。
WENR 方案在类器官的研究与实践中不断演化，通过与其他细胞因子或小分子抑制剂的巧妙结合，衍生出适用于多种类器官构建的培养条件。目前，WENR 方案已在胃、小肠、结肠、胰腺、肝脏等多种类器官培养中得到广泛应用。
WENR方案用于多种类器官培养（源自Bindi M. Doshi, PhD. www.labroots.com）
WENR“四大护法”
WENR 方案源于对干细胞微环境的深度解析。研究发现，肠道、肝脏、胰腺等器官的干细胞生态位中，Wnt 信号通路、EGF 信号通路、BMP 信号通路的动态平衡是维持干细胞自我更新与分化的关键。通过模拟这一微环境，科学家筛选出这四类核心因子。
WENR方案在肺类器官培养中的作用（源自文献：doi: 10.3390/cancers14092144）
Wnt-3a：干细胞增殖的“发动机”
Wnt-3a 作为经典 Wnt 通路的激活剂，通过稳定 β-catenin 蛋白，启动下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），参与细胞发育、增殖和分化过程。Alessandra Merenda在其综述中深入总结了Wnt信号通路在类器官领域的关键作用。文中指出，无论成体干细胞组织来源如何，其衍生的类器官在增殖、干性维持及终末分化特化细胞等关键环节，都依赖于经典 Wnt 信号通路。如在小鼠结肠类器官的建立过程中，添加外源性 Wnt-3a 对于其增殖至关重要。而不添加 Wnt-3a，类器官超过 3 天后无法存活。
Wnt-3a在肠类器官中培养中的作用（源自文献：doi: 10.1016/j.tcb.2019.10.003）
EGF：细胞增殖的“加速器”
表皮生长因子（EGF）与受体结合，激活 MAPK/ERK 通路，促进细胞增殖和存活。EGF 刺激上皮细胞增殖、血管生成和表皮细胞分化，促进类器官三维结构的形成。EGF 广泛应用于胃肠道、肝脏、甲状腺等类器官培养，促进细胞集落形成和组织结构稳定性。尽管 EGF 并非类器官形成的必需因子，但能显著增加类器官体积。
优化的WENR方案在人胃肠道类器官构建过程中的应用（源自文献：doi: 10.1186/s13619-020-00040-w）
Noggin：抑制分化的“守门员”
Noggin是一种骨形态发生蛋白（BMP）的内源性抑制剂，通过阻断 BMP 与受体结合，促进干细胞增殖，为类器官形成提供充足的细胞。Noggin 还通过抑制 BMP 信号通路，维持干细胞干性，影响细胞的命运决定和分化过程。在类器官培养中，Noggin 常与 Wnt-3a 和 R-Spondins 一起使用，以平衡 BMP 和 Wnt 信号通路，促进类器官的生长和分化。因此，Noggin 在类器官培养中不仅促进增殖，还精细调控细胞的分化。
Noggin抑制细胞增殖的分子机制（源自文献：doi: 10.1242/bio.20149977）
R-Spondins：Wnt信号的“放大器”
R-spondin 是 Wnt 信号通路的激活剂，通过与 Frizzled 和 LRP5/6 受体结合，增强 Wnt 信号在多种组织中的表达，促进干细胞增殖与类器官结构形成。T. Thalheim等人发现，没有 R-spondin 存在时，类器官在 4-5 天后停止生长。在 1.2% R-spondin 浓度下培养的类器官生长非常迅速，生长时间超过 5 天后经常破裂，其管腔内积累了大量细胞碎片。在 10% 或 25% 的 R-spondin 浓度下培养的类器官生长速度比 1.2% 稍慢，但不会破裂。
不同浓度的R-spondin影响肠类器官的生长状态（源自文献：doi: 10.1016/j.ydbio.2017.10.013）
WENR经典方案使用小Tips
Wnt 过度激活会导致类器官结构紊乱，因此 Wnt-3a 浓度需严格控制。并且 R-spondin 需要和 Wnt-3a 协同使用，单独使用效果有限。建议根据类器官类型优化 Wnt-3a 的浓度，一般为 50-100 ng/mL。在培养后期也可以动态调控其浓度。
EGF 易被蛋白酶降解，建议使用无血清培养基。EGF 长期高浓度，可能会诱导异常分化，建议定期更换培养基。EGF 一般使用浓度为 50 ng/mL。在肿瘤类器官（如肠癌）中，其浓度需根据癌细胞特性调整。
Noggin 与 Wnt-3a 协同作用，支持胃、肠道、肝脏、肺、胰腺等类器官的长期培养。在肺类器官培养中，Noggin 缺失会导致肺泡上皮细胞过早分化。在肝类器官中，其与 Wnt3a 的“双剑合璧”是长期传代的关键。BMP 信号的过度激活会导致类器官形成囊状结构，失去功能性隐窝结构。
R-spondin 有4个亚型（RSPO 1-4），不同组织来源的类器官可能需特异性选择。Wnt-3a 和 R-spondin 易失活，建议分装后 -80℃ 保存。
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参考文献：
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