导师
小李，这批衰老组织样本的 WB 结果怎么又没有统计学意义啊？这结果靠谱么！
老师，数据重复性有点差，而且内参蛋白 β-actin 的条带也总是深浅不一，我也不知道咋办了。
小李
导师
是不是蛋白浓度没有拉齐，上样量不一样？
拉齐了，蛋白定量试剂我都换新的了，内参还是不齐。
小李
我又把上样量按照 β-actin 重新做了调整，但是……目的蛋白没趋势了！
小李
导师
β-actin 这个内参适合衰老组织么？你查查文献
…… 第二天 ……
BBQ 了，有文献报道 β-actin 有时候表达会不稳，有些期刊还要求对内参进行验证，我该怎么办？
小李
导师
咱们的样品还够做验证吗？
样品只够再跑一次的，验证完就不够做正式实验了。
小李
导师
做实验最糟心的就是数据趋势与预期大相径庭，多次重复试验，次次结果不一致，甚至连内参都选不明白。甚至搞不好，还要落个学术不端的帽子！尤其在做衰老组织的 WB 实验时，这样的问题总是频繁出现。为了助力广大科研人员破解衰老相关疾病研究中的 WB 难题，我们总结了以下「痛点」及解决方案：
01
衰老相关疾病研究中 WB 痛点直击
1. 目的条带太难出
（点击查看原因分析及解决方案）
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2. 目的蛋白趋势总不对
（点击查看原因分析及解决方案）
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3. 内参蛋白不稳定
（点击查看原因分析及解决方案）
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小小内参蛋白竟然对 WB 实验结果有这么多影响？甚至很容易被忽略。近年来已有研究发现，多个经典内参蛋白在衰老组织中的表达并不稳定！
02
哪些内参不适合用于衰老组织的 WB 实验？
2025 年 2 月，来自德州大学达拉斯分校行为与脑科学学院神经科学系的一项研究，对胚胎期（E15-P0）和出生后（P0-P20，Adult）小鼠皮质样本中的 GAPDH、β-actin 和 β-tubulin 进行了总蛋白归一化的 WB 分析[1]。结果显示，在出生到成年早期，小鼠皮层中 GAPDH 蛋白水平明显增加，β-actin 和 β-tubulin 水平降低。
图源：参考文献[1]
2020 年 7 月，加拿大的一项研究通过总蛋白归一化的 WB 分析，比较了 7 月龄和 22 月龄（老年）小鼠神经组织中的蛋白质丰度[2]。细胞骨架蛋白的分析显示，老年小鼠 Actin 和 Tubulin 蛋白水平发生变化。而 Stain-Free 免染总蛋白在不同神经组织部位（突触小泡、粗突触体、含有突触小泡的 LP1 上清液、突触体膜、可溶性突触体膜、突触后密度）的表达更为恒定。
图片来源：参考文献[2]
上述研究揭示，GAPDH、β-actin 和 β-tubulin 蛋白不适合作为衰老相关疾病 WB 研究中的内参蛋白。为了避免经典内参蛋白不准确的问题，研究人员已经在相关研究中引入了新的内参—Stain-free 总蛋白内参！
2024 年 1 月，发表在 Nature Aging（IF 17.0）上的一项研究发现，抑制 S6 激酶 （S6K）可降低与年龄相关的炎症，并通过内溶酶体系统延长寿命[3]。该研究中所有的 WB 分析部分，均采用了 Stain-free 总蛋白内参对目标蛋白表达情况进行归一化分析。
图片来源：参考文献[3]
03
Stain-Free 总蛋白内参技术揭秘
Stain-Free 免染成像原理：Stain-Free 免染技术是一种 Bio-Rad 开发的用于 Western Blot 实验中的总蛋白归一化方法。该技术使用独特的三卤化合物使蛋白质具备直接在凝胶中发荧光的功能，且仅需短时间的紫外光激活步骤，可检测低至 10～25 ng 的蛋白质。可在约 4 小时内实现五分钟封闭、抗体孵育和印迹检测 — 比传统方法更快！
总蛋白内参归一化的计算方法：通过测量印迹膜上每个泳道的总蛋白条带密度及泳道轮廓来确定每个泳道的上样量，并进行内参归一化计算。每个泳道中所有的条带密度总和减去总背景来进行背景扣除。
04
为什么要选择免染总蛋白内参
精准定量，科研数据更可靠
与管家蛋白相比，免染总蛋白内参提供更可靠的上样内参。
图片来源：参考文献[4]
线性比较：使用 10～50 µg HeLa 细胞裂解物作为样品，三种管家蛋白和免染总蛋白的线性差异。左图中（a）是膜上的免染总蛋白，（b）、（c）、（d）分别为 β-actin、β-tubulin 和 GAPDH 的化学发光条带。泳道标签对应于总蛋白上样量（μg）。尽管 β-actin 和 β-tubulin 信号呈线性，但光密度比仍远低于实际加样的预测「响应值」，而免染信号与预期结果相一致（e）
与其他总蛋白归一化方法（如 Ponceau S）相比， Stain-Free 方法在各种条件下都能保持高准确性和精确度。
图片来源：参考文献[5]
便捷高效，实验流程大提速
可在电泳结束后，代替考马斯亮蓝染色，检测样品提取效果。
优势点：免染与考染相比，具有更高的可重复性数据和较小的变异系数。考马斯染料与蛋白免疫印迹或质谱分析不兼容，免染技术与大多数下游实验兼容。
图片来源：Bio-Rad 官网
线性动态范围：免染技术用于总蛋白质测量。A. HeLa 细胞裂解稀释液上样，80～2.5 µg 总蛋白；B. 细胞裂解稀释液上样，20～1 µg 总蛋白。
可在转膜结束后，代替丽春红 S 染色，检测蛋白转印效果。
优势点：与丽春红 S 染色相比，观察到的条带强度不取决于染色或脱色的持续时间，且条带强度不会随时间降低，可以在短暂的 2 分钟内验证蛋白质的转印效率。
图片来源：Bio-Rad 官网
评估蛋白质转印：使用免染成像系统评估转印效率。使用 Stain-Free 成像仪拍摄转印前后的凝胶和转印后的膜图像。将血红蛋白的 1:2 梯度稀释液（起始量为 80 ng），与 1.8 µg BSA/泳道一起电泳（上面条带为 BSA），在 4～20% 的 26 孔 Criterion Stain Free 凝胶上进行电泳分离。
广泛适用，满足多元科研需求
免染成像技术与 Western Blotting 化学发光/多色荧光检测完全兼容。能够轻松应对各种研究领域，包括热门的肿瘤[6]、神经系统[7]等研究方向。
Bio-Rad 公司匠心打造的免染内参蛋白，正以卓越的性能和创新的技术，成为众多实验室的不二之选。选择 Bio-Rad 免染内参蛋白，就是选择更精准、更高效、更广泛适用的科研伙伴。如您有兴趣了解更多关于Bio-RAD Stain-Free 免染总蛋白内参技术，或希望申请试用，欢迎点击下方二维码立即申请。
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注：
1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。
2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
3. 本活动的最终解释权归伯乐生命医学产品（上海）有限公司。
内容策划：王丹琦
内容审核：周育红
题图来源：参考文献[1]
参考文献
[1] Rodriguez D, Nguyen M, Devata T, Patel D, Tavares-Ferreira D, Nguyen LH. GAPDH, β-actin, and β-tubulin display age-dependent protein expression changes in the mouse cortex during development. Dev Neurosci. 2025 Feb 10:1-17. doi: 10.1159/000544064.
[2] Neris RLS, Dobles AMC, Gomes AV. Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Advantages of Stain-Free Technology. Methods Mol Biol. 2021;2261:443-456. doi: 10.1007/978-1-0716-1186-9_28.
[3] Zhang P, Catterson JH, Grönke S, Partridge L. Inhibition of S6K lowers age-related inflammation and increases lifespan through the endolysosomal system. Nat Aging. 2024 Apr;4(4):491-509. doi: 10.1038/s43587-024-00578-3. Epub 2024 Feb 27.
[4] Taylor SC, Posch A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Res Int. 2014;2014:361590. doi:10.1155/2014/361590
[5] Maloy A, Alexander S, Andreas A, Nyunoya T, Chandra D. Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data. Anal Biochem. 2022;654:114840. doi:10.1016/j.ab.2022.114840
[6] Hu X, Du S, Yu J, et al. Common housekeeping proteins are upregulated in colorectal adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma, making the total protein a better "housekeeper". Oncotarget. 2016;7(41):66679-66688. doi:10.18632/oncotarget.11439
[7] Lanzillotta C, Baniowska MR, Prestia F, et al. Shaping down syndrome brain cognitive and molecular changes due to aging using adult animals from the Ts66Yah murine model. Neurobiol Dis. 2024 May 4;196:106523. doi: 10.1016/j.nbd.2024.106523.
