近日，中国医学科学院苏州系统医学研究所叶子璐研究员和团队开发出一套新的单细胞蛋白质组学工作流程——Chip-Tip。
图 | 叶子璐（来源：叶子璐）
Chip-Tip 的检测灵敏度有着巨大飞跃，他们在一颗 HeLa 细胞中鉴定出了超过 5000 种蛋白质，这是以前难以想象的深度。
更令人兴奋的是，还能直接在单细胞水平观测到蛋白质的翻译后修饰（比如磷酸化、糖基化等）。而传统方法通常需要额外的富集步骤才能检测这些修饰，多细胞实验尚且如此，单细胞就更加难以做到。而 Chip-Tip 突破了这个限制，在一颗细胞中就识别出多种修饰的蛋白。
这说明本次方法提供了前所未有的全面视角。相比以前的一些单细胞蛋白质组方法，不需要引入载体蛋白（有些传统方法会混入额外细胞来提升信号），也不需要对样本做复杂预处理，就能又快又灵敏地完成分析。
因此，Chip-Tip 大幅提升了单细胞蛋白质组学的灵敏度和通量，克服了长期以来困扰该领域的许多技术难题。
（来源：Nature Methods）
之所以具备这些亮点，是因为这一方法包含了从样本制备到检测分析的一系列创新。
首先，在样本制备上，他们设计并使用了一种名为 ProteoCHIP EVO 96 的微型芯片。简单来说，就是把单个细胞放进芯片上极小的孔里进行处理。通过压电声学技术，能在纳升级体积中完成细胞裂解和蛋白质提取，这样就最大程度减少了蛋白质粘附在管壁上或丢失的情况。
传统方法处理这么微量的样本时常常损失严重，而他们的芯片等于是给每个细胞准备了一个“迷你容器”，保证把细胞里的蛋白都抓取出来。每个芯片最多可以并行处理 96 个单细胞样本，这使得只需一次实验就能分析许多细胞，大大提高了效率。
其次，在检测技术上，他们结合了当前最先进的质谱分析手段。利用高速高灵敏度的液相色谱-质谱联用系统（比如最新一代的 Orbitrap Astral 质谱仪），可以在不进行任何标记或富集的情况下直接检测单个细胞的蛋白质。
审稿人认为，这项技术在单细胞蛋白质组学领域实现了重要突破，一举解决了灵敏度和规模化两个大问题，达到了以前难以达到的深度。还有审稿人评论说 Chip-Tip 工作流程为该领域设立了新的标杆，这让该团队备受鼓舞。
在论文发表后，Nature Methods杂志方告诉研究团队，他们专门邀请了一位审稿专家撰写评论文章（也称News & Views）来介绍和评价这项成果。
“能够得到这样的待遇，是对我们工作的充分肯定——一般只有被认为具有重大影响力的研究，杂志才会邀请同行专家撰写独立评论。评论文章中，专家对我们工作的创新意义给予了高度评价，认为这项技术推动了领域进入深度单细胞蛋白质组学时代。”叶子璐表示。
Chip-Tip 的应用前景十分广泛，尤其是与大数据和 AI 技术相结合后，将进一步加速科学发现。目前主流的单细胞研究主要集中在单细胞转录组（scRNA-seq）水平，蛋白质层面的数据是缺失的。
单细胞蛋白质组学能直接测量每个细胞内的蛋白质表达情况，更精准地反映细胞的状态和功能。未来，通过大数据分析与 AI 算法的助力，单细胞蛋白质组学将发挥更大的作用。
比如：利用 AI 快速分析数以万计的单细胞蛋白数据，发现新的细胞类型与生物标志物；结合 scRNA-seq 数据，构建多组学分析模型，深入揭示细胞发育轨迹与疾病发生的分子机制；以及开发智能药物筛选平台，快速评估药物在单细胞水平上的治疗效果，加速精准药物的开发和临床转化。
（来源：Nature Methods）
单细胞蛋白质组学的能力亟待提升
蛋白质是生命活动最直接的执行者，蛋白质组学研究能够帮助我们深入理解细胞、组织以及人体的功能机制，这对疾病的诊断、治疗和预防都具有重要价值。近年来，国际上蛋白质组学的研究迅速发展，在国内也得到了越来越多的关注。
例如，由中国科学院院士贺福初领衔启动的“π-HuB”（人体蛋白质组导航国际大科学计划），正是中国在这个领域的重要布局。
该计划希望通过蛋白质组学技术和数据科学的结合，系统性地绘制不同人体组织和疾病状态下蛋白质表达变化的“地图”，从而帮助理解人体的健康与疾病发生的规律，也为疾病诊断和精准医学提供基础的数据支撑。
随着生命科学的发展，人们已经不再满足于对成千上万个细胞混合后得到的平均值进行研究，而是希望直接观察每一个细胞内部发生了什么。
单细胞蛋白质组学就是在单个细胞层面研究蛋白质的种类和丰度，它的重要性在于：不同的细胞即使基因相同，蛋白质表现也可能千差万别。
比如，在肿瘤中不同癌细胞对药物的反应可能不同，只有看清每个细胞的蛋白质情况，才能理解这种差异。又比如，在干细胞分化过程中，每个阶段细胞内哪些蛋白在变化，单细胞分析可以给出前所未有的细节。
因此，单细胞蛋白质组学被认为能够极大改变人们对细胞功能和疾病机制的认识。但是，以往要测定单个细胞中的成千上万种蛋白非常困难。
主要瓶颈有几个：
- 其一是灵敏度不足——单个细胞的蛋白质含量极其微量，传统质谱技术往往检测不到足够信号；
- 其二是样本处理复杂——从单个细胞提取和保存全部蛋白质很不容易，过程中容易有损失；
- 其三是数据分析难度高——单细胞的数据本来就少，还混杂噪音，常规算法难以区分有意义的信号。
正是因为看到这些挑战和单细胞分析的巨大潜力，他们才决心开展这项研究，希望开发出新技术来提升单细胞蛋白质组学的能力。
（来源：Nature Methods）
一波三折，在蛋白质组学的激烈竞争中前进
此前已有不少研究关注单细胞层面的分析，但大多集中在细胞转录组的层面，而蛋白质作为生命活动的真正执行者，信息更加丰富。
可是，由于单个细胞中蛋白质含量极低，传统技术通常面临两个问题：一是单细胞样品处理步骤复杂、样品损失严重；二是蛋白质的鉴定数量有限，一般只能检测到 1000-2000 个蛋白质，难以全面反映细胞的真实功能状态。
为了解决这个问题，他们设计了 Chip-Tip。设计思路是通过简化样品的处理过程，减少蛋白质损失，从而提高单细胞内蛋白质的鉴定数量。
同时，他们设计并制作了专门的芯片，将所有样品处理步骤都整合到芯片的微小孔内完成，整个过程中样品几乎没有损失，且能批量高效地同时处理多个细胞样品。
在最初的预实验阶段，他们先尝试了用这种新芯片分析单个 HeLa 细胞，利用全自动单细胞分选仪把单个细胞准确地送入芯片孔内，加入裂解液释放出细胞内蛋白质，再将蛋白质酶解成便于质谱检测的小片段（肽段）。然后，这些肽段被直接送入液相色谱和质谱仪进行分析。
初步结果非常令人振奋——他们能够从单个细胞中准确地鉴定出超过 5000 种蛋白质，这远远超过传统方法的检测能力。这表明他们的 Chip-Tip 方法可行，值得深入研究。
在随后的正式实验中，他们进一步评估了多个细胞数量（如单个细胞、10 个细胞、20 个细胞和 40 个细胞）的蛋白质检测效果。结果发现，随着细胞数量的增加，能检测出的蛋白质数量也明显增加。
同时，他们意外地发现 Chip-Tip 甚至可以直接检测出蛋白质上发生的磷酸化等重要的“翻译后修饰”，单个细胞中首次鉴定出超过 120 个磷酸化修饰位点。
这一结果令他们非常惊喜，因为此前在单细胞水平从未如此精细地观察到这些蛋白质修饰的信息。为了验证 Chip-Tip 方法在实际研究中的应用价值，他们又将它用于分析肿瘤细胞在药物处理前后的蛋白质变化，以及诱导多能干细胞分化为不同类型细胞的过程中蛋白质表达变化，结果证明这项技术确实能发现与细胞功能和状态相关的重要蛋白质标志物。
整个研究历时几年的时间，从早期提出问题，到系统技术开发，再到成功发表，他们经历了许多技术挑战和反复实验。
但最终，他们不仅证明了 Chip-Tip 的高效性和可靠性，也首次实现在单个细胞中识别数千种蛋白质及其关键翻译后修饰。这一成果让他们可以更加深入、全面地理解细胞功能，推动生命科学研究更快向前发展。
（来源：Nature Methods）
另据悉，这项研究的最初想法起始于 2019 年底。当时叶子璐刚刚加入丹麦哥本哈根大学杰斯珀·奥尔森（Jesper Olsen）教授课题组从事博士后研究。
那时候，单细胞蛋白质组学领域正逐渐兴起。一些研究团队开始使用同位素标记技术，通过添加大量载体蛋白质（carrier proteome）来提高单细胞检测的灵敏度。
但是，叶子璐当时所在课题组以及其他同行对这种方法存在一些疑虑，认为可能存在干扰或误差，也就是所谓的“载体蛋白质组效应”（Carrier proteome effect）。
于是，叶子璐的第一个课题就是对这一效应进行系统性的研究与评估。研究刚进行不久，他们就注意到一支德国团队的类似论文已于 2020 年发表在了Nature Methods上。
后来他们发现，德国团队的研究实际上比他们早启动了很久，严格意义上并不算抢发（scoop），但的确给他们带来了一些挫折感。
后来，叶子璐等人认真地研读了德国团队的成果，发现了一些方法上的不足，决定进一步优化研究策略，寻找新的突破口。
接下来，他们又尝试开发超高通量靶向单细胞蛋白质组分析技术，但很遗憾在他们进行到一半时，一支美国团队又率先发表了类似论文，这使他们再次感受到了单细胞蛋白质组学领域激烈的竞争压力。
这些早期研究虽然遇到了不少挑战，却帮助他们积累了大量的经验，也让他们对单细胞蛋白质组学技术的发展路径有了更清晰的理解。
此时，叶子璐等人决定转向无标记定量的单细胞蛋白质组学分析。凭借前期积累的丰富经验，再加上与 Evosep 和 Cellenion 公司的深度合作，他们最终开发出了 Chip-Tip 这一全新的、几乎无损的单细胞蛋白质组学技术。
2023 年 11 月，他们抢先一步在BioRxiv预印本平台上发表了 Chip-Tip 方法的相关论文，首次展示了单细胞中超过 5000 种蛋白质的精准鉴定，在单细胞蛋白质组学领域引起极大关注。
此后不久，另一支美国团队和一支维也纳团队的类似论文也相继发表，但叶子璐这一次终于抢占先机。他们的了被Nature Methods顺利接收，审稿过程仅经历一轮小修便获得认可。
然而碰巧的是，2024 年Nature Methods杂志选择空间蛋白质组学（Spatial Proteomics）作为年度主推技术，这让编辑部的审稿和出版工作有所延迟。
“不过整体而言，这次研究项目从最初的艰难探索到最终取得重大突破，整个过程虽然曲折，但却极大推动了单细胞蛋白质组学领域的发展。”叶子璐表示。
日前，相关论文以《增强的灵敏度和可扩展性与芯片尖端工作流程相结合，可实现深入的单个细胞蛋白质组学》（Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics）为题发在Nature Methods[1]。
叶子璐是第一作者兼共同通讯作者，丹麦哥本哈根大学杰斯珀·奥尔森（Jesper Olsen）教授担任共同通讯作者。
图 | 相关论文（来源：Nature Methods）
用“短跑”新技术做“从 0 到 1”的研究
叶子璐表示：“我在奥尔森教授实验室工作期间，单细胞蛋白质组学领域的竞争非常激烈，很多时候我们的研究都面临着‘你不做别人也会做’的压力。这种‘数字游戏’（即谁率先获得更好的数据）在某种意义上推动了领域的发展。”
“尽管我们多次被同行抢先一步，但总体来看我们团队的工作效率仍然非常高，最终也取得了一系列高质量的研究成果。从某种意义上来说，我们在这个‘数字游戏’里算是表现不错的‘玩家’，而这样的激烈竞争，也的确加速了整个蛋白质组学领域的技术进步。”他表示。
然而，这样的竞争也促使叶子璐反思，他希望回到国内组建自己团队时，能够做一些真正意义上的原创性研究，即能够“从 0 到 1”，而不仅仅是“数量”上的比拼，更希望做出不易被抢发的、真正具有原创性价值的研究。
他继续说道，回国之后从人才招募到平台搭建，团队整体效率还算比较高，但初期原创技术的开发和高质量数据产出的速度还是不够快，很多工作仍需从零开始积累。
不过在这种模式下，他和团队也开始做出一些令人兴奋的进展，其中最值得一提的是他们研发的一款名为 SPRINT 的单细胞蛋白质组学样品前处理仪器。
Chip-Tip 虽然在单细胞蛋白质检测灵敏度方面取得了突破，但叶子璐更希望进一步提升分析的通量（number of cells）。
正如前面提到的，Chip-Tip 一次可以处理最多 96 个单细胞样本。尽管这已经相对不错，但如果面对更大规模的研究或者临床应用需求，96 个/批次可能仍嫌不够。
为此，他和团队在规划一种代号为 SPRINT 的新技术平台。这个名字有“短跑”之意，寓意着高速和高效。SPRINT 平台打算在 Chip-Tip 现有流程的基础上，再向前迈进一步——进一步减少人工操作、让整个流程更加高效。
目前，他们正在开发的 SPRINT 原型仪器正是朝这个目标迈出的关键一步。此外，他们在组织样品的自动化处理、超高通量液相色谱分析方法的研发方面也都与多个工业界和学术界团队建立了深度合作，正在快速配合实现关键突破。
眼下，叶子璐已经展开了这方面的研究，希望能把每天分析的单细胞数量从现在的一百来个提升到几百甚至上万个。
未来，他的目标是打造类似于 10x Genomics 那样的平台型技术公司，希望不仅能够为学术界提供强大的技术工具，也能服务于更广泛的生物医药产业。虽然现在仍处于前期规划阶段，但团队已经在逐步准备。
参考资料：
1.Ye, Z., Sabatier, P., van der Hoeven, L.et al. Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics.Nat Methods22, 499–509 (2025). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02558-2
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