复方1区: 温州医大&贵州医大多组学联合探讨苗药银丹心脑通方可减轻NAFLD的作用机制

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

背景：非酒精性脂肪肝（NAFLD）是全球范围内日益严重的慢性肝病，目前尚无有效的治疗药物。中医（TCM）在中国和其他亚洲国家已有数千年的历史，被认为是发现治疗各种疾病的新药的重要来源。苗药银丹心脑通方（YDX）是通过降低血脂含量来治疗高脂血症的经典中药，但其在NAFLD中的作用尚未明确。

目的：探讨YDX对高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠的保护作用，并阐明其潜在机制。

方法：通过HFD饲养10周来构建NAFLD小鼠模型，并给予YDX用于改善治疗。我们进行了血脂代谢指标、生化指标和组织病理学染色，以评估肝脏脂质积累和肝脂肪变性的程度；16S rRNA测序用于确定肠道微生物组成；我们采用血清代谢组学通过UPLC-Q-TOF/MS分析研究NAFLD相关生物标志物的变化，随后通过肝脏转录组学鉴定差异表达基因并探索基因调控途径，通过Western blot和ELISA检测脂质代谢相关蛋白和炎症因子。

结果：YDX能显著降低模型小鼠的体重增加、肝脏指数和炎症细胞因子水平，改善肝脂肪变性、血脂水平、对胰岛素的敏感性和对葡萄糖的耐受性，并增强了氧化防御系统。此外还显著影响了肠道微生物群的多样性和群落丰富度，降低了厚壁菌门/拟杆菌门的比例。同时YDX还能减少模型小鼠血清中有害脂质代谢物的产生，如LPC(18:0)、LPC(18:1)和肉碱。值得注意的是，与肝脏转录组学结果一致，YDX通过激活Ampk通路，下调了肝脏中与脂质从头合成有关的蛋白（Srebp-1c、Acaca、Fasn、Scd-1和Cd36）和促炎细胞因子（IL-6和TNF-α）的表达，并增加了与脂肪酸β氧化有关的蛋白（Ampkα、Ppar-α和Cpt-1）的表达。

结论：YDX通过调节Ampk通路、抑制肠道微生物群紊乱和减少有害脂质代谢物的产生，有望成为预防NAFLD的有效疗法。

论文ID

原名：Multi-omics joint analysis reveals that the Miao medicine Yindanxinnaotong formula attenuates non-alcoholic fatty liver disease

译名：多组学联合分析显示苗药银丹心脑通方可减轻非酒精性脂肪肝疾病

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

发表时间：2024.09

通讯作者：刘林&郑江&李艳梅

通讯作者单位：温州医科大学，贵州医科大学

实验设计

实验结果

1. YDX降低HFD诱导的NAFLD小鼠的体重和肝脏脂肪堆积

为了研究YDX对NAFLD的治疗效果，我们对C57BL/6 J小鼠进行了为期10周的HFD喂养。如图1A-B所示，从第六周开始，HFD组小鼠的体重明显高于YDX-H组。与HFD组（43.43±3.02 g）相比，YDX-L组（41.12±2.04 g）和YDX-H组（37.25±2.35 g）在YDX干预10周后的最终体重增加呈降低趋势。与体重的变化一致，YDX的剂量依赖性逆转了HFD诱导的小鼠附睾脂肪重量的增加（图1C）。此外与各组小鼠的图像一致，HFD组的肝脏重量和肝脏指数显著高于对照组（P<0.001），而YDX治疗显著逆转了这一变化（图1D-E）。同样，HFD组小鼠肝脏形态粗大、体积增大、外观呈淡黄色，YDX干预后显著缓解了以上症状（图1F）。结果显示，喂食高脂饮食的NAFLD小鼠肝脏出现气球变性、过多脂滴和炎性细胞浸润（图1G-H，蓝黑箭头所示），表明高脂饮食诱发了肝脏脂肪变性和炎性病灶。YDX组的肝脏切片显示出非常轻微的肝脏脂肪变性和炎症病灶，尤其是在高剂量组。总之以上研究结果表明，YDX能有效减轻HFD喂养的NAFLD小鼠的肝脏脂肪变性和炎症浸润。

图1 YDX对HFD诱导的NAFLD小鼠的影响。每天分别通过口服灌胃给C57BL/6 J小鼠低剂量YDX（YDX-L，1.0 g YDX/kg BW）、高剂量YDX（YDX-H，4.0 g YDX /kg BW）和生理盐水（对照组，CN），持续10周。（A）正常脂肪饮食喂养、高脂饮食喂养和YDX加高脂饮食喂养小鼠的体重变化。（B）最终体重增加值。（C）CN、HFD和YDX组小鼠的腹部脂肪重量。（D-E）第10周CN、HFD组和YDX组小鼠的肝脏重量和肝脏指数。（F）CN、HFD和YDX组小鼠10周时肝脏照片。(G-H)用H&E染色的肝组织（×200倍放大）和油红O染色的肝组织（×400倍放大）显示小鼠的病理形态学变化（n=8）。数据为平均值±标准差（SD，n=10）。与CN组相比，##P<0.01和###P<0.001；与HFD组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

2. YDX可改善高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的血清生化指标

通常NAFLD疾病会伴随着葡萄糖稳态和胰岛素敏感性受损。为了研究YDX对脂质稳态的影响，我们检测了小鼠的血清脂质指标。如图2A所示，与HFD组相比，随着YDX剂量的增加，NAFLD小鼠血清TG、TC和LDL-C水平显著降低，而血清HDL-C水平的变化与YDX剂量呈正相关。同时HFD组小鼠血清葡萄糖和胰岛素水平分别比空白对照组高0.69倍和1.04倍，而YDX治疗后可逆转这些变化，且呈剂量依赖性（图2B-C）。如图2D所示与药物治疗相比，低剂量和高剂量YDX也分别显著降低了HFD组小鼠的HOMD-IR(P<0.05,P<0.001)。此外，我们还通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）进一步检测了HFD组小鼠在服用YDX药物10周后的葡萄糖清除能力。结果如图2E显示腹腔注射葡萄糖（1.5 g kg-1）后，随着时间的延长YDX治疗组的血糖水平降低，在120 min时高剂量YDX组的血糖含量与对照组相似。OGTT的AUC变化表明，与对照组相比，YDX治疗显著提高了HFD诱导的NAFLD小鼠的葡萄糖清除能力（图2F）。这些数据表明，YDX可以回调高脂饮食诱导小鼠因血脂水平失调引起的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量的损伤。

接下来我们探讨了YDX对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠因脂质代谢紊乱引起的肝损伤的影响。如图2G所示与对照组相比，HFD组小鼠的血清AST和ALT水平分别显著升高了66.05%和63.9%。尽管如此YDX治疗仍能明显改善这些变化。在HFD组相比，高剂量干预YDX组的血清AST和ALT水平分别比成功降低了36.2%和38.11%。与血清肝功能指标水平的变化一致，HFD组小鼠口服YDX可显著降低血清MDA水平（P<0.01，P<0.001），且呈剂量依赖性（图2H）。作为抗氧化系统的关键指标，与HFD组相比，GSH/GSSG和GPx的水平会随着YDX剂量的增加呈现出显著上升趋势（图2I-J）。此外与对照组相比，HFD饲喂导致血清中LPS水平明显升高，而与HFD组相比，YDX组则显著降低血清中LPS的含量（图2K）。同时HFD组小鼠血清中炎症细胞因子IL-6和TNF-α的水平显著升高（P<0.001），而YDX组小鼠中IL-6和TNF-α的水平显著低于HFD组（图2I-M）。

图2 YDX对HFD诱导的NAFLD小鼠血清生化指标和糖耐量的影响。血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的水平。(B-F)血清葡萄糖水平、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、OGTT的AUC、血清胰岛素和胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）的变化。（G）CN、HFD和YDX组小鼠的肝功能指标ALT和AST水平。(H-J) MDA、GSH/GSSG、GPx、脂多糖水平变化。(I-M)炎症细胞因子IL-6、TNF-α的水平。数据以均数±标准差表示（n=10）。与CN组相比，###P<0.001；与HFD组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

3. YDX调节HFD诱导的NAFLD小鼠的肠道菌群

为了进一步研究YDX对NAFLD小鼠肠道微生物群的影响，我们选取了对照组、HFD组和YDX-H组（n=5），通过16S rRNA测序分析肠道微生物群。如图3A-C所示，与对照组相比，HFD诱导的NAFLD小鼠肠道微生物群的α多样性显著降低，而YDX-H组治疗后则可恢复其多样性。同时为了研究不同样本中肠微生物群结构的变化，我们还进行了β多样性测定。如图3D-F所示，OPLS-DA、PCoA和NMDS的OTU水平分析表明，对照组和HFD组的肠道微生物群之间存在显著差异，而YDX组与对照组则相互靠近，表明HFD喂养小鼠的肠道微生物群在YDX治疗后趋于恢复到正常水平。上述结果表明，YDX对HFD诱导的NAFLD小鼠紊乱的肠道微生物群具有显著的恢复作用。

此外如图3G所示，在门的水平上，拟杆菌门、疣微菌门、脱铁杆菌门、变形菌门和厚壁菌门是最主要的种群，而它们在不同群体肠道微生物群中的相对丰度差异很大。在本研究中HFD组的F/B比值比对照组低60.73%，而YDX治疗后F/B比值显著升高（P<0.05）（图3H）。从菌属水平来看，HFD组小鼠中普氏梭杆菌、醋杆菌、颤螺菌、脱硫弧菌、臭杆菌、沙氏粘螺菌和另枝菌属的相对丰度显著低于对照组，而巴氏杆菌、罗斯氏菌和梭菌簇XIVa的相对丰度显著高于对照组（图3I-J），YDX干预则显著逆转了这一变化。此外线性判别分析（LDA）和效应大小测量（LEFSe）显示有27个高维生物标志物显示出从门到属的统计学显著性和生物学一致性差异（LDA socre>4）（图3K），该分析表明有5个的LDA值大于5.0。此外梭菌簇XIVa、Clostridiales、梭菌属、厚壁菌门和毛螺菌科被确定为HFD组的生物标志物，而脱硫弧菌科、脱硫弧菌属和变形菌门是YDX回调更显著的菌属。这些结果表明，YDX可调节肠道微生物群的丰度，从而改善高脂饮食所致NAFLD小鼠的肝损伤。

图3 YDX对NAFLD小鼠肠道微生物群多样性和群落丰富度的影响。（D）OPLS-DA、（E）基于非加权Unifrac的PCoA和（F）非计量多维标度（NMDS）图。(G)门级微生物群组成的平均相对丰度。(H)厚壁菌门与拟杆菌门的比例。(I)属级的肠道微生物群热图。(J)热图显示三组小鼠肠道微生物群在属一级的相对丰度分析。(K)三组差异微生物群的LDA评分柱状图。数据为平均值±标准差（SD，n =5）。与CN组相比，###P<0.001；与HFD组相比，*P<0.05和**P<0.01。

4. 基于血清非靶向代谢组学探讨YDX对NAFLD的保护作用

我们采用非靶向代谢组学方法研究了小鼠血清中代谢物的变化，通过主成分分析（PCA）对QC样品进行聚类分析，结果表明LC-MS/MS系统和样品处理过程稳定，具有良好的重现性（图S1A）。PCA评分图显示，对照组和HFD组呈显著差异，这意味着HFD小鼠存在明显的代谢紊乱，而YDX治疗后代谢紊乱得到显著改善（图4A）。这些结果表明，YDX可调节HFD引起的代谢紊乱。随后，我们建立了OPLS-DA模型来分析对照组、HFD组和YDX-H组小鼠的代谢变化。如图4B所示，在OPLS-DA评分图中，对照组、HFD组和YDX-H组之间显著分离。R2Y表示模型对Y矩阵的解释率和Q2模型的预测能力，结果表明该模型具有良好的拟合度和预测能力。

随后，我们根据VIP>2、FC>1和P<0.05来确定各组间显著改变的代谢物，在HFD组小鼠中筛选出50种代谢物，YDX干预小鼠中筛选出43种差异代谢物。随后，我们选择这些代谢物进行t检验分析，以找到特定的代谢生物标志物。结果表明有11种差异代谢物对小鼠血清代谢的影响（图4I和图S1B）。在这11种血清生物标记物中，与对照组相比，HFD组有4种标记物（如LPC(18:0)、LPC(18:1)、LPC(14:0)和肉碱）显著增加，7种标记物（油酰-l-肉碱、3-羟基丁酰肉碱、3-羟基油酰肉碱、l-棕榈酰肉碱、己酰-l-肉碱和亚油酰肉碱）显著减少。与HFD组相比，这个11种生物标志物在YDX干预后得到了一定程度的恢复，这表明YDX能有效改善NAFLD小鼠血清中异常生物标志物的水平。

图4 YDX治疗对HFD诱导的NAFLD小鼠血清代谢谱的影响。（A）CN组、HFD组和YDX-H组血清代谢谱的PCA评分图。（B）OPLS-DA评分图。(C) HFD组与CN组差异代谢物火山图。(D) YDX-H vs HFD差异代谢物火山图。(E-F) CN 组和HFD组血清代谢谱的OPLS-DA评分图及模型排列图。（G-H）HFD组和YDX组的OPLS-DA评分图及模型的排列图。（I）11种不同代谢物的相对丰度。数据为平均值±标准差（SD，n=5）。与CN组相比，###P<0.001、##P<0.01和#P<0.05；与HFD组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

5. YDX影响NAFLD小鼠肝脏中的基因表达

接下来，我们通过RNAseq分析评估了YDX治疗NAFLD小鼠肝脏脂肪变性的改善是否与肝组织中基因表达谱的调控有关。如图5A所示，PCA图显示三组之间有显著分离，而YDX组比HFD组更接近对照组，这表明YDX组比HFD组与对照组有更高的相似性。图5B显示了差异表达基因（DEGs）在HFD组小鼠中的显著变化，包括1390个上调基因和1432个下调基因。与HFD组相比，YDX治疗后HFD组小鼠有701个基因上调，604个基因下调。热图分析表明，YDX的干预逆转了HFD导致的代谢紊乱小鼠中679个基因的异常表达水平，使其恢复到接近正常水平（图5D）。

此外，我们还对679个DEGs进行了KEGG通路富集分析。结果显示YDX治疗NAFLD的机制主要涉及调控脂肪酸代谢、PPAR信号通路、类固醇激素的生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、胰岛素信号通路、氨基酸的生物合成、丙酮酸代谢、Ampk 信号通路、胰高血糖素信号通路、糖酵解/糖原生成和脂肪酸的生物合成（图5E）。更具体地说，对整个转录组进行的基因组富集分析（GSEA）证实，HFD诱导的NAFLD小鼠在脂质代谢过程和脂肪酸生物合成过程的调控方面表现出强烈的富集特征，而YDX的干预则显著逆转了这些特征（P<0.01）。值得注意的是，参与脂质代谢过程和脂肪酸生物合成过程的基因表达变化与YDX治疗后小鼠的体重和血脂水平（TC、TG、LDL-C和HDL-C）密切相关（图5H）。

图5 YDX处理后肝脏的转录组学分析。(A) PCA图。(B) HFD组和对照组以及YDX组和HFD组之间的差异表达基因（DEGs）。(C) 维恩图。(D) 三组差异基因表达的聚类热图。(E)脂酸生物合成和脂质代谢的基因组富集分析(GSEA)。(F) 脂酸生物合成和脂质代谢通路差异基因表达的聚类热图。(H)Spearman热图分析。

6. YDX通过调节关键脂质代谢相关蛋白的表达来改善肝脂肪变性

根据上述结果，我们确定了YDX治疗后NAFLD小鼠肝脏中与脂质代谢和脂肪酸生物合成过程相关的关键调控基因，随后利用WB技术检测了与脂质代谢相关的关键基因及其转录调控因子的蛋白表达水平，如Acaca、Fasn、Scd-1、Srebp-1c、Cd36、Ppar-α、Cpt-1和Ampkα（图6A）。结果如图6B-F所示，与对照组相比，HFD组小鼠肝脏中Acaca、Fasn、Scd-1、Srebp-1c和Cd36蛋白表达量分别显著增加了1.46倍、1.39倍、3.74倍和0.71倍，而YDX干预后显著逆转了这一趋势，且呈剂量依赖性，尤其是在高剂量组。此外与对照组相比，HFD组的Cpt-1、Ampkα和Ppar-α蛋白表达发生了轻微的变化（P>0.05），而YDX则显著上调了这些蛋白的表达（图6G-I）。

图6 YDX对小鼠肝脏脂质代谢相关蛋白表达水平的影响。（A-I）分别给YDX组和HFD组的C57BL/6 J小鼠每天口服低剂量YDX（YDX-L，1.0 g YDX/kg BW）和高剂量YDX（YDX-H，4.0 g YDX /kg BW），持续10周后进行Srebp-1c、Acaca、Fasn、Cd36、Scd-1、Ampkα、Ppar-α、Cpt-1蛋白表达水平的WB分析。结果以平均值±标准差表示（n=3）。与CN组相比，###P<0.001、##P<0.01和#P<0.05；与HFD组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

为了进一步研究YDX对脂质代谢紊乱的治疗作用，我们评估了YDX对油酸（OA）诱导的HepG2细胞肝脂肪变性模型的保肝作用。如图7A-B所示，ORO染色显示，与OA处理组相比，随着YDX血清浓度的增加，OA诱导的HepG2细胞中的脂滴积聚显著减少。图7C显示，与正常组相比，OA诱导的HepG2细胞中TG水平显著升高，而YDX药物抑制了OA引起的细胞TG生成。此外流式细胞术和荧光倒置显微镜还测定了HepG2细胞中的ROS水平。与对照组相比，OA处理24 h后，细胞内绿色荧光强度显著增加，表明OA诱导的脂质积累导致HepG2细胞内ROS水平明显升高（图7D）。如图7E-F所示，与OA组相比，YDX药物血清显著降低了ROS水平（P<0.001），且呈剂量依赖性。此外，我们还探讨了YDX药物血清对OA诱导的肝细胞损伤的保护作用。如图7G-I所示，与正常组相比，经OA处理24小时后，AST、ALT和MDA水平显著升高。相比之下YDX药物血清干预逆转了这些变化，尤其是15% YDX药物血清处理组。OA诱导的HepG2细胞中GSH/GSSG和GPx的含量分别比未经OA预处理的对照组显著降低了50.49%和50.71%。如图7J-K所示，这些结果进一步证实了YDX在减轻OA介导的肝细胞脂质沉积和脂毒性方面的积极作用。

图7 YDX药物血清对OA诱导的HepG2细胞脂质积累、氧化应激标记物和细胞损伤的影响。(A) OA诱导脂滴积累后HepG2细胞的油红O染色（×100）。(B)油红O染色后用异丙醇洗脱的油红O染料在530 nm波长处的吸光度。(C)OA诱导的HepG2细胞中的TG水平。（D）使用荧光显微镜（×100）通过DCFH-DA染色法测量细胞内ROS的产生。(E-F）用流式细胞仪和微孔板检测DCF荧光强度。(G-K)检测OA诱导的HepG2细胞的AST、ALT、GSH/GSSG、GPx指标水平。结果以平均值±标准差表示（n=3）。与CN组相比，###P<0.001；与HFD组相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

8. 生化和病理指标与肠道微生物群和不同代谢生物标志物的相关性分析

在上述生化指标、病理指标、肠道微生物群和不同血清代谢生物标志物分析的基础上，进一步分析了高脂饮食诱导的NAFLD小鼠生化指标和病理指标变化与肠道菌群的相关性。如图8A所示，Flavonifractor、Odoribacter、Alistipes、脱硫弧菌属、Mucispirillum、Acetatifactor、Pseudoflavonifractor 和 Oscillibacter 与HDL-C和GPx呈正相关，而Ruminoooccus、梭菌簇XIVa和Barnesiella与HDL-C和GPx呈负相关；而生化和病理指标，包括MDA、LPS、TC、TG、肝重、体重、GLU、IL-6、TNF-α和胰岛素，与Odoribacter、Alistipes、脱硫弧菌属、Mucispirillum、Acetatifactor、Pseudoflavonifractor和Oscillibacter呈负相关，与Ruminoooccus、梭菌簇XIVa和Barnesiella呈正相关。

为了探索生化和病理指标与潜在生物标志物之间的潜在联系，我们分析了16个生化和病理指标与11种差异代谢生物标志物之间的相关性。从热图（图8B）中发现，4种差异代谢生物标志物LPC(18:0)、LPC(18:1)和肉碱与MDA、LPS、TC、TG、肝重、体重、GLU、IL-6、TNF-α 和胰岛素等生化和病理指标呈正相关，而与HDL-C、GSH/GSSG和GPx分别呈显著负相关。此外，我们还发现在YDX治疗后，小鼠血清中的HDL-C、GSH/GSSG和GPx水平呈上升趋势，这些指标与7种代谢物呈正相关，与4种代谢物呈负相关。

图8 生化和病理指标与肠道微生物群和血清差异代谢生物标志物的相关性分析。(A)Spearman相关性分析；(B)差异代谢生物标志物与生化和病理指标数据的关系。图中的空白区域表示P>0.05，星号（*、**和***）标记的区域表示P<0.05，P<0.01，P<0.001。

结论

NAFLD正迅速成为一种全球流行病，也是慢性肝病的最常见原因，在全球范围内造成了广泛的医疗保健和经济负担。而长期摄入高脂肪饮食是NAFLD的主要原因之一，可引发新陈代谢紊乱、肠道菌群失衡、氧化应激、胰岛素抵抗和促炎细胞因子的产生，这些与NAFLD的发生密切相关。然而目前除了通过改变生活方式进行早期预防外，没有有效的药物可用于预防和治疗NAFLD。因此迫切需要开发能够阻止或逆转NAFLD进展的有效多靶点药物。在本研究初步实验中，我们发现YDX是一种传统的苗药，可有效减轻HFD诱导的NAFLD小鼠的体重并改善肝脂肪变性。然而YDX如何抑制NAFLD进展的机制尚不清楚。

体重增加、胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱、肝脂肪变性、抗氧化防御功能下降和炎症反应是脂质代谢紊乱引起的NAFLD的常见特征。在本研究中YDX组小鼠用YDX（1.0 和 4.0 g YDX/kg BW）干预并喂食HFD，持续治疗10周。YDX治疗显著降低了体重增加、肝脏指数和血清促炎细胞因子水平（TNF-α、IL-6），同时还改善了HFD诱导的NAFLD小鼠的血脂代谢和肝脂肪变性。这些结果表明，YDX通过抑制脂质代谢紊乱和炎症反应，有效缓解HFD诱导的NAFLD小鼠的进展。此外YDX干预显着降低了血清胰岛素和葡萄糖水平，并改善了葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗，这是促进NAFLD和NASH进展的关键驱动因素。值得注意的是，YDX显著逆转了NAFLD小鼠GPx和GSH/GSSG水平的降低以及肝功能指数和MDA水平的增加，从而防止了脂毒性引起的肝损伤，这与之前的研究一致。以上结果表明，YDX可有效抑制HFD诱导的小鼠NAFLD的进展。因此，了解YDX作用的具体机制需要进一步研究，这可能为NAFLD的临床治疗提供潜在的新策略。

近年来，大量研究表明，肠道菌群的组成和多样性与各种代谢疾病密切相关，包括NAFLD和糖尿病。在这项研究中，16S rRNA测序分析表明，HFD喂养可显著改变了NAFLD小鼠肠道微生物群的组成和多样性，这与之前的研究一致，而这在YDX治疗后往往会恢复到健康状态。特别是厚壁菌门和拟杆菌门是人类肠道菌群中的两个优势门，厚壁菌门与拟杆菌门的比例（F/B）与代谢稳态的维持密切相关，该比例的变化可能导致NAFLD。本研究发现，YDX增加了HFD降低的F/B比率，表明YDX参与了肠道微生态平衡的调节。此外变形菌门也是肠道菌群的主要成分之一，通过产生促炎因子（包括LPS）与炎症反应密切相关，因此在HFD诱导的NAFLD的进展中起关键作用。在本研究中NAFLD小鼠中变形菌门的丰度高于正常组，而YDX在门水平上变形菌门的相对丰度有轻微的恢复趋势。

在属水平上，HFD组Odoribacter、Alistipes、Flavonifractor、Oscillibacter、Pseudoflavonifractor、脱硫弧菌属、Mucispirillum和Acetatifactor的相对丰度与正常小鼠相比显著降低，而梭菌簇XIVa和Barmesiella的相对丰度正好相反（图S2A-K）。然而在YDX干预后都显示出回调的变化。先前的研究报告称，Odoribacter、Alistipes、Acetatifactor、Oscillibacter、Acetatifactor和Pseudoflavonifractor对产生短链脂肪酸（SCFA）的肠道菌群有益，以增强肠道屏障并降低肠道通透性和LPS水平。研究还显示类似的结果，YDX干预后NAFLD小鼠Odoribacter、Alistipes、Acetatifactor、Oscillibacter、Flavonifractor和Pseudoflavonifractor的丰度变化与血脂水平（TG、TC和LDL-C）和血清炎症因子（TNF-α、IL-6 和 LPS）水平呈负相关。脱硫弧菌属与NAFLD小鼠的肝脂肪变性和肝脂质代谢呈负相关，这与我们的发现一致。此外Mucispirillum是一个与HFD诱导的NAFLD小鼠脂质代谢紊乱改善相关的菌属，其丰度在YDX治疗组中显著增加，并且与TG和TC呈负相关。此外先前的研究表明，HFD导致梭菌簇XIVa和Barmesiella的丰度增加，从而导致脂质代谢紊乱和肝脂肪变性，促进NALFD的进展。研究表明，YDX处理的小鼠中梭菌簇XIVa和Barmesiella的丰度显著降低。这些结果表明，YDX干预可通过抑制肠道菌群失衡和增加肠道菌群的组成和多样性，有效改善HFD引起的NAFLD的发展。

大量研究表明，HFD可导致正常小鼠和NALFD小鼠之间血清中代谢物质的差异变化，因此血清生物标志物代谢物也是反映体内代谢状态是否正常的关键指标。在本研究中结果显示YDX治疗后HFD诱导的NALFD小鼠中LPC（18：0）、LPC（18：1）、LPC（14：0）和肉碱等11种潜在生物标志物显著逆转。LPC主要由PLA2催化的磷脂酰胆碱（PC）形成，并导致巨噬细胞浸润和活化，分泌炎性细胞因子，加剧肝脏炎症、脂质代谢失衡和脂质积累诱导的肝损伤，在我们的研究中也发现了类似的结果，LPC（18：0）、LPC（18：1）和LPC（14：0）与炎性细胞因子（IL-6 和 TNF-α）、肝功能指标（ALT、AST和MDA）和血脂水平（TG和TC）呈正相关，与HDL-C、GSH/GSSG和GPx水平呈负相关。此外由过度脂质积累引起的脂毒性可下调肉碱棕榈酰转移酶I（Cpt-I）表达，从而防止肉碱和长链酰基结合形成酰基肉碱，导致肉碱含量增加和酰基肉碱含量降低。此外YDX给药后，β-羟基丁酸酯的相对丰度显着增加。因此YDX处理可能上调Cpt-1的表达，导致HFD诱导的NAFLD小鼠肉碱含量显着降低和酰基肉碱水平增加，进而增加脂肪酸β氧化。这些结果表明YDX可以通过促进脂肪酸β氧化和抑制有害代谢产物的产生来改善脂质代谢紊乱、肝损伤和炎症反应，从而缓解NAFLD的发展。

在本研究中，YDX处理的HFD诱导的NAFLD小鼠肝脂肪变性的转录组学分析表明，脂肪酸生物合成和脂质代谢的改变是受YDX处理影响最显著的途径。与以往的研究一致，高脂饮食引起的脂肪酸生物合成基因表达上调和脂质氧化基因表达下调与NAFLD的发生密切相关。因此，YDX可能通过重塑肝脏脂质代谢对NAFLD发挥治疗作用。本研究进一步分析显示YDX干预显著上调与脂肪酸氧化相关的蛋白质及其关键调节因子（Ampkα、Ppar-α和Cpt-1）的表达，并降低与脂肪酸合成相关的蛋白质如Cd36、Srebf1（Srebp-1c）、Acaca、Fasn和Scd-1的表达，从而降低肝脏脂质积累引起的脂毒性和炎症反应（图S3A-B）。作为脂质代谢的关键调节因子，p-Ampkα可以通过下调 Srebf1（Srebp-1c）的蛋白表达来增加Ppar-α蛋白表达和抑制脂肪酸合成途径，从而上调Cpt-1的表达以促进脂质降解，表明Ampkα可能是YDX调节脂质代谢的靶标之一。先前的一项研究表明，Srebp-1c是脂肪酸合成的关键转录因子，可以上调脂质合成酶Acaca、Fasn和Scd-1，从而促进脂质合成和脂肪积累。此外Cd36被称为脂肪酸转位酶，可增强血清中细胞游离脂肪酸的摄取，进而增加肝细胞中的脂质积累。此外我们进一步验证了YDX药物血清对游离脂肪酸诱导的肝脂肪变性细胞模型的缓解作用。结果显示，YDX药物血清显著降低了细胞模型中脂质积累、ROS水平以及TG和MDA含量，并提高了游离脂肪酸还原的GPx和GSH/GSSG含量，表明YDX中的活性成分还可以通过调节脂质代谢和抑制脂毒性直接发挥保肝作用。以上结果表明，YDX可通过激活Ampk通路有效抑制脂肪酸从头合成，促进脂肪酸氧化，增强抗氧化系统功能，从而改善脂质积累诱导的肝脂肪变性和肝细胞损伤。

结论

总之结果证明，YDX缓解了HFD诱导NAFLD小鼠疾病的发展。根据16S RNA序列、血清代谢组学和肝脏转录组学分析的研究，其潜在机制可能涉及YDX表现出的抗NAFLD作用：（1）YDX可以通过增加肠道菌群的组成和多样性，降低厚壁菌门与拟杆菌门的比例，显著抑制促炎因子引起的炎症反应，改善NAFLD小鼠肠道菌群紊乱;（2）YDX可通过激活Ampk途径促进脂肪酸氧化，抑制从头脂肪酸，增强抗氧化系统功能，显著减少肝脏脂肪变性、肝损伤和脂质积累过多引起的有害脂质代谢物的产生（图9）。总之研究表明YDX在缓解HFD诱导NAFLD方面发挥了积极作用，这可能为NAFLD的临床治疗提供潜在的新策略。