【写在前面】：本期推荐的是由广西大学联合广西中医药大学研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示石胡荽（鹅不食草，Centipeda minima）提取物通过内质网应激/HMOX1/Fe²⁺/活性氧（ROS）途径发挥抗肝癌作用。
【期刊简介】
【题目及作者信息】
Centipeda minima extract exhibits anti-liver cancer effects via the ER stress/HMOX1/Fe2+/ROS pathway
背景：鹅不食草（CM），在传统中医中已有数千年的应用历史，主要用于治疗鼻炎、鼻部过敏和癌症。然而，CM对肝癌的作用机制及其活性成分尚未明确。
目的：揭示鹅不食草提取物（ECM）对肝癌的抗癌作用及其分子机制。
方法：通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）鉴定鹅不食草乙醇提取物（ECM）中的化合物。将两种剂量的ECM通过灌胃方式给予携带HepG2细胞的小鼠，持续24天，以评估其体内抗肿瘤效果。此外，将三种剂量的ECM添加到细胞中，通过克隆形成、细胞周期、凋亡、划痕愈合、Transwell实验、Western blot以及Fe²⁺和活性氧（ROS）检测等实验，评估其体外抗癌效果。同时，通过网络药理学和RNA测序分析ECM对肝癌的作用机制。
结果：ECM显著阻滞肝癌细胞周期于G2/M期，诱导细胞凋亡，并抑制细胞侵袭和迁移。此外，ECM在不影响小鼠体重的情况下抑制了肿瘤生长。机制上，ECM通过内质网应激上调HMOX1的表达，导致Fe²⁺和ROS的积累以及细胞凋亡。此外，ECM通过下调N-钙黏蛋白（N-cad）和上调E-钙黏蛋白（E-cad）抑制细胞迁移和侵袭。
结论：鹅不食草提取物（ECM）可能主要通过内质网应激/HMOX1/Fe²⁺/ROS途径抑制肝癌的进展，为肝癌的治疗提供了一种潜在的策略。
（图文摘要）
【前言】
在各类癌症中，肝癌的发病率位居第六，2020年约有90.6万例新发病例。由于其发病隐匿且进展迅速，许多患者在确诊时已处于中晚期，失去了根治性切除的机会。因此，系统药物治疗已成为主要的治疗手段，尽管其临床疗效有限。因此，开发新型抗肝癌药物至关重要。
一种药物发现的策略是从传统中药（TCM）中筛选具有抗癌特性的活性成分。事实上，包括淫羊藿苷、华蟾素颗粒、艾迪注射液、金龙胶囊、莪术醇、复方斑蝥胶囊等在内的多种现代中药制剂已被推荐用于治疗晚期肝癌。此外，中药复方和草药提取物，如西黄丸、七竹抗癌方和叶下珠提取物，也显示出良好的抗肝癌效果。由于多靶点、整体效应和较少的副作用，中药在改善症状、控制病情和降低肿瘤复发率方面具有独特优势。
石胡荽（Centipeda minima，简称CM），在中药中称为鹅不食草，广泛分布于中国北方和西南地区。除了用于治疗鼻炎、鼻窦炎和鼻部过敏外，CM还被用于消肿止痛已有数千年历史，这与中医“活血化瘀”治疗肝癌的理念相契合。药理研究表明，CM对多种癌症（如肺癌、鼻咽癌和乳腺癌）具有抑制作用。通过阻断PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPK信号通路，CM能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。已从CM中鉴定出的化学成分包括萜类、黄酮类、甾醇类和酚类。然而，关于CM在肝癌中的活性成分及其作用机制的研究较少。
本研究通过网络药理学、RNA测序以及体内外实验，揭示了CM对肝癌的有效成分及其潜在机制。这些发现为进一步研究CM的作用机制提供了基础，并为开发抗肝癌药物提供了参考数据。
【结果】
1、ECM的化学成分
为了解ECM的化合物组成，我们通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）和UPLC实验对其进行了定性和定量分析。图1A和图1B分别展示了在正离子和负离子模式下ECM的总离子色谱图（TICs）。利用UNIFI软件（UNIFI 1.9，Waters），我们根据参考标准品的相对保留时间、质谱特征碎片以及文献数据（Chan等，2016），对ECM中的化合物进行了鉴定。最终鉴定出12种活性化合物（见表1）。由于阿尼柯内酯D（Arnocolide D）、阿尼柯内酯C（Arnocolide C）和布雷维林A（Brevilin A，化合物10-12）是倍半萜内酯，因此在负离子模式下未检测到（图1B）。图1C和图1D分别展示了ECM和混合标准品的UPLC色谱图。
2、ECM显著抑制HepG2荷瘤小鼠模型中的肿瘤生长
通过HepG2荷瘤小鼠模型，我们研究了ECM的体内抗增殖作用。结果显示，ECM对肿瘤生长的抑制作用显著且呈剂量依赖性（图2A）。在800 mg/kg剂量的ECM处理组中，与对照组相比，肿瘤重量和体积分别减少了54.5%和53.9%（图2B和C）。此外，我们持续监测了小鼠的体重。低剂量和高剂量ECM组的小鼠体重未出现明显下降，而5-FU组则出现了两次显著的体重下降（图2D）。
3、ECM显著降低肝癌细胞的活性
随后，我们评估了ECM对五种肝癌细胞系的细胞毒性作用。结果显示，ECM对细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性（图3A）。在PLC/PRF/5、MHCC-97L、Bel-7402、MHCC-97H和HepG2细胞中，ECM的半数抑制浓度（IC50）分别为37.2 ± 1.1、26.8 ± 1.9、23.2 ± 1.1、20.9 ± 2.6和17.6 ± 3.1 μg/ml（图3B）。由于HepG2和MHCC-97H细胞对ECM最为敏感，因此后续实验中选择了这两种细胞系。ECM显著抑制了HepG2和MHCC-97H细胞的克隆形成（图3C）。
4、ECM在HepG2和MHCC-97H细胞中阻滞细胞周期于G2/M期并诱导凋亡
随后，我们研究了ECM对HepG2和MHCC-97H细胞周期和凋亡的影响。结果显示，ECM显著诱导细胞周期阻滞于G2/M期（图4A）。在HepG2细胞中，与对照组（19.5 ± 2.1）相比，G2/M期的比例分别为：5 μg/ml时为23.4 ± 1.3（p = 0.05），10 μg/ml时为50 ± 2.5（p < 0.001），20 μg/ml时为45.7 ± 2.7（p < 0.001）。在MHCC-97H细胞中，G2/M期的比例分别为：对照组为17.3 ± 1.5，10 μg/ml时为20.5 ± 1.4（p = 0.06），20 μg/ml时为31.7 ± 5.3（p = 0.01），30 μg/ml时为50.3 ± 6.2（p < 0.001）。此外，ECM处理后观察到显著的细胞凋亡（图4B）。
ECM显著抑制HepG2和MHCC-97H细胞的迁移和侵袭
划痕实验表明，ECM以剂量和时间依赖性方式抑制细胞迁移（图4C）。对于HepG2细胞，24小时时的迁移率分别为：对照组为13.32 ± 1.66，5 μg/ml时为5.04 ± 2.42（p = 0.008），10 μg/ml时为3.31 ± 1.62（p = 0.002），20 μg/ml时为1.58 ± 1.48（p < 0.001）；48小时时的迁移率分别为：对照组为25.14 ± 3.67，5 μg/ml时为6.81 ± 5（p = 0.007），10 μg/ml时为4.75 ± 2.38（p = 0.001），20 μg/ml时为2.58 ± 1.27（p < 0.001）。对于MHCC-97H细胞，24小时时的迁移率分别为：对照组为10.03 ± 0.65，10 μg/ml时为3.72 ± 1.18（p = 0.001），20 μg/ml时为2.42 ± 0.44（p < 0.001），30 μg/ml时为1.62 ± 1.02（p < 0.001）；48小时时的迁移率分别为：对照组为15.31 ± 1.57，10 μg/ml时为4.62 ± 1.32（p < 0.001），20 μg/ml时为3.03 ± 0.89（p < 0.001），30 μg/ml时为2.18 ± 0.83（p < 0.001）。Transwell实验表明，ECM能够抑制肝癌细胞的侵袭（图4D）。
随后，我们检测了凋亡和迁移相关调控因子的表达。促凋亡蛋白（包括Bax和裂解的PARP [CL-PARP]）以及抗迁移标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达上调，而抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促迁移标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达下调（图4E）。
5、网络药理学研究ECM对肝癌的作用
上述结果表明，ECM具有显著的体外和体内抗肝癌特性。我们通过网络药理学方法揭示了ECM中的活性成分及其潜在的抗肝癌机制。首先，我们鉴定出305个ECM的抗肝癌靶基因（图5A）。对这些靶基因进行GO富集分析显示，富集的生物过程（BP）术语包括活性氧代谢过程、凋亡信号通路的调节、有丝分裂细胞周期G2/M期的调节、上皮细胞迁移和细胞间黏附的调节（图5B）。此外，癌症通路、PI3K-AKT通路和凋亡通路富集显著（图5C）。随后，我们构建了一个包含346个节点和1297条相互作用线的“化合物-靶点”网络图（图5D）。通过Cytoscape 3.10.2软件中的CytoNCA工具，筛选出核心化合物，包括布雷维林A（Brevilin A）、阿尼柯内酯C（Arnico-lide C）和阿尼柯内酯D（Arnico-lide D）。
6、HMOX1被鉴定为介导ECM抗肝癌效应的关键因子
为了验证网络药理学的结果，我们采用RNA测序分析了对照组和ECM处理组之间的差异表达基因（DEGs），共鉴定出268个DEGs（图6A）。在这些DEGs中，有7个基因（AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、CYP1B1、MMP13、PDGFRB和HMOX1）与ECM的305个抗肝癌靶点重叠（图6B）。随后，我们通过RT-qPCR验证了这7个基因的差异表达。值得注意的是，HMOX1在两种细胞系中表现出最大的差异丰度（图6C）。因此，我们推测ECM可能通过上调HMOX1发挥其抗肝癌效应。为了验证这一假设，我们首先检测了ECM处理后肝癌细胞和肿瘤组织中HMOX1的表达。结果显示，HMOX1的表达以剂量依赖的方式被ECM上调（图6D和E）。HMOX1是一种应激反应蛋白，通常位于内质网（ER）中（Jagadeesh等，2022）。内质网应激可以激活下游信号通路，从而引发转录激活（Wang等，2024a）。为了研究内质网应激对ECM诱导的HMOX1上调的影响，我们将HepG2和MHCC-97H细胞与4-PBA（一种内质网应激抑制剂）和ECM共同处理。结果显示，4-PBA缓解了ECM诱导的HMOX1上调，表明ECM部分通过内质网应激上调HMOX1（图6F）。
随后，我们评估了HMOX1在ECM诱导的细胞活性抑制中的作用。HMOX1的siRNA（siHO1 #1）没有干扰效率，而siHO1 #2则能显著降低HMOX1的表达（图6G）。值得注意的是，通过siHO1 #2下调HMOX1显著减弱了ECM诱导的细胞增殖抑制，并改善了ECM诱导的细胞凋亡（图6H和I）。这些结果表明，ECM通过HMOX1介导的凋亡发挥其抗肝癌效应。
7、ECM通过HMOX1/Fe²⁺/ROS轴诱导肝癌细胞凋亡
HMOX1是一种限速酶，可以降解血红素，从而释放铁。过量的铁可以通过芬顿反应产生活性氧（ROS）。鉴于ECM上调了HMOX1的表达，我们推测ECM可能促进细胞内铁和ROS的积累。结果显示，ECM以剂量依赖的方式增加了细胞内Fe²⁺和ROS的含量（图7A和C）。抑制HMOX1可减轻ECM诱导的Fe²⁺积累（图7B）。铁螯合剂去铁胺甲磺酸盐（DFO）显著缓解了ECM诱导的ROS积累和细胞活性抑制（图7C和D）。这些结果表明，ECM通过HMOX1/Fe²⁺/ROS轴诱导细胞凋亡。
8、ECM中的活性成分ArC上调HMOX1表达，阻滞细胞周期于G2/M期，诱导凋亡，并抑制HepG2和MHCC-97H细胞的侵袭和迁移
鉴于HMOX1的上调介导了ECM的抗肝癌效应，我们进一步研究了阿尼柯内酯C（ArC）对肝癌的抑制作用，因为网络药理学分析预测HMOX1是ArC的靶点。我们首先通过分子对接分析了ArC与HMOX1之间的相互作用。结果显示，ArC的结合能（-8.54 ± 0.02 kcal/mol）低于HMOX1的配体SLV-8289（-7.64 ± 0.06 kcal/mol）（表2和图8A）。ArC和SLV-8289的预测结合值（pKi）分别为6.27 ± 0.04和5.61 ± 0.04（表2）。均方根偏差（RMSD）轨迹曲线围绕其平均值波动，表明HMOX1-阿尼柯内酯C复合物结构达到了稳定状态（图8B）。我们进一步通过Western blot验证了ArC对HMOX1的影响，结果表明ArC也能增加HMOX1的表达（图8C）。此外，我们还探讨了ArC对细胞周期、凋亡、侵袭和迁移的影响。与ECM相比，ArC也能诱导G2/M期阻滞和凋亡，并抑制HepG2和MHCC-97H细胞的侵袭和迁移（图8D-G）。
ECM具有抗过敏、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用，其中抗肿瘤效果尤为引人关注。研究表明，ECM及其活性成分（如短叶老鹳草素A、山金车内酯C和山金车内酯D）可通过抑制Skp2/p27信号通路，诱导细胞周期阻滞并减少非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的迁移。此外，ECM还可通过抑制AKT、NF-κB和STAT3信号通路对三阴性乳腺癌发挥治疗作用。然而，ECM对肝癌的影响及其机制尚未明确。
本研究首次发现，ECM能够显著抑制肝癌细胞的生长，通过阻滞细胞周期于G2/M期、诱导凋亡以及抑制侵袭和迁移。机制上，ECM通过内质网应激上调HMOX1的表达，导致Fe²⁺和ROS的积累，最终诱导细胞凋亡。同时，ECM通过增强E-钙黏蛋白（E-cad）的表达并降低N-钙黏蛋白（N-cad）的表达来限制细胞迁移和侵袭。这些发现填补了ECM在肝癌研究中的空白。
HMOX1是一种关键酶，能够催化血红素转化为一氧化碳、胆绿素和铁。其高表达通常与多种癌症的不良预后相关，但也在铁死亡（ferroptosis）中发挥积极作用。本研究首次发现，ECM通过RNA测序鉴定的差异表达基因（DEGs）显著富集在铁死亡通路中，并上调HMOX1，导致Fe²⁺的积累。沉默HMOX1或使用铁死亡抑制剂去铁胺（DFO）均能缓解ECM对细胞活性的抑制和ROS的积累。这表明ECM通过内质网应激/HMOX1/Fe²⁺/ROS轴发挥抗肝癌作用。
通过网络药理学分析，我们发现布雷维林A、山金车内酯C和山金车内酯D是ECM中抗肝癌的潜在核心成分。这些化合物在多种癌症中表现出与ECM类似的疗效，如诱导细胞周期阻滞、促进凋亡和抑制细胞迁移和侵袭。尽管关于山金车内酯C的研究较少，但本研究发现其能够上调HMOX1、诱导凋亡并抑制细胞迁移和侵袭。
索拉非尼是首个用于晚期肝癌治疗的多靶点激酶抑制剂，但其响应率较低且易产生耐药性。相比之下，ECM在临床应用中不良反应较少，且在体内表现出良好的安全性。因此，ECM在肝癌治疗中具有显著的临床潜力。
本研究的局限性在于，尽管ECM通过内质网应激上调HMOX1的作用已被证实，但其确切机制仍不清楚。此外，考虑到中药的多靶点特性，ECM的抗肝癌效应可能还涉及其他机制，需要进一步研究。
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