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Introduction
孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder，ASD）是一种以社交功能障碍和重复性行为为特征的异质性神经发育障碍。世界卫生组织发布的最新报告估计，约每100名儿童中有1名患有ASD，男性患病率高于女性，且发病率呈逐步上升趋势。ASD严重影响患者及其家庭的正常生活，给社会带来巨大负担。虽然早期行为和教育干预可以在一定程度上改善ASD患者的表观遗传症状，但对ASD核心症状的有效防治措施仍然非常有限。
肠道菌群是指生存在胃肠道中的微生物群落，被称为第二基因组，其微生物细胞数量是人体细胞的10倍。近年来，有研究报道肠道菌群对ASD至关重要，大多数ASD患者肠道菌群发生了改变并出现严重的胃肠道问题。大量研究表明，丙戊酸（valproic acid，VPA）处理小鼠的肠道菌群与正常小鼠不同，各种膳食和营养干预措施已被报道可以通过重塑肠道微生物来缓解ASD样行为障碍及其相关并发症。
孕前、孕期和幼儿期营养干预是预防和治疗ASD症状的一种可行且经济有效的方法。有报道称，补充特定营养素如胆碱、氨基酸、VB12、VB6、VD、叶酸等可以降低ASD的发病率，减轻ASD症状。L-脯氨酸（L-proline，Pro）是一种多功能氨基酸，对氧化应激、碳氮代谢和细胞信号传导至关重要。据报道，ASD患者血清Pro水平明显低于正常人，在饮用水中添加5-氨基戊酸（Pro的Stickland菌的发酵产物）可以改善BTBR小鼠的重复行为和社交行为。
中国农业大学黄昆仑教授、仝涛副教授课题组 在本文中通过VPA诱导ASD小鼠模型评估Pro改善ASD样行为的潜力，并从肠道菌群和前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）转录组的角度，阐明其潜在的分子机制。
Results and Discussion
膳食补充Pro可减少VPA诱导的ASD小鼠模型中的重复行为和社交障碍
在埋珠实验和理毛实验中，1%的Pro补充能够减少VPA诱导的ASD小鼠模型中增多的重复行为，例如显著减少埋珠数量，明显减少理毛时间（图1）。
图1 补充Pro可减少VPA诱导的ASD小鼠模型中的重复行为
社交功能障碍是ASD患者最显著的特征之一，本文通过三箱实验来考察三组小鼠的社会偏好性和社会新颖性（图2A）。研究结果表明，Pro补充可以一定程度上扭转ASD小鼠受损的社交偏好性（图2B、C）和社交新颖性（图2D、E），改善ASD小鼠的社交功能障碍。
图2 补充Pro可减少VPA诱导的ASD小鼠模型中的社交功能障碍
在VPA诱导的ASD小鼠模型中，Pro调节肠道菌群结构和组成
近年来的研究结果表明，肠道菌群可以调节包括ASD在内的神经系统疾病。本文基于16S rRNA测序分析了小鼠的粪便肠道菌群，结果表明Pro可以显著调节VPA处理小鼠的肠道菌群结构（图3）。
图3 补充Pro可调节VPA诱导的ASD小鼠模型的肠道菌群结构
利用LDA联合LEfSe分析鉴定Pro对肠道菌群组成的影响，研究结果如图4所示，VPA组的优势菌群为unclassified_c__Bacilli菌目、unclassified_c__Bacilli菌科、unclassified_c__Bacilli菌属，Pro补充组的优势菌属为Rikenella和Turicibacter（图4）。
图4 Pro调节VPA诱导的ASD模型小鼠肠道菌群的组成
在VPA诱导的ASD小鼠模型中，补充Pro可以调节小鼠肠道菌群的功能
如图5所示，VPA和Pro处理显著改变了多条肠道菌群参与的信号通路。与SAL组相比，VPA处理的小鼠肠道菌群参与的神经退行性疾病、感染性疾病、细菌和免疫系统的代谢途径降低，而Pro显著增强了这些代谢途径，说明Pro可以在一定程度上逆转VPA处理引起的肠道菌群功能的改变。
图5 基于KEGG途径的粪便微生物组功能预测
在VPA诱导的ASD小鼠模型中，补充Pro可逆转PFC的病理改变、氧化应激和血脑屏障损伤，并减轻全身炎症
PFC的尼氏染色结果显示，Pro补充可逆转ASD小鼠PFC的形态学病理损伤（图6A、B）。Pro补充可显著扭转VPA诱导的ASD小鼠PFC中MDA含量的升高（图6C）。Pro补充显著降低了VPA处理增加的小鼠血清中IL-6和TNF-α（图6D、E）。此外，Pro补充可以显著提升ASD小鼠血脑屏障标志基因（Occludin、ZO-1）的mRNA水平（图6F、H）。这些结果表明，在VPA诱导的ASD小鼠模型中，补充Pro可以减轻小鼠PFC的氧化应激和血脑屏障损伤，并逆转全身炎症。
图6 补充Pro可逆转ASD小鼠PFC的病理改变、氧化应激和血脑屏障损伤，并减轻全身炎症
补充Pro可以改变VPA诱导的ASD小鼠模型中PFC的基因表达谱
为了进一步研究Pro改善ASD小鼠相关行为障碍的机制，本文对各组小鼠的PFC进行了RNA测序。研究结果显示，Pro补充可以调节ASD小鼠PFC的基因表达谱，在一定程度上逆转VPA处理对小鼠PFC基因表达的调节，并调控SFARI数据库中相关ASD易感基因的表达（图7）。
图7 补充Pro可以改变VPA诱导的ASD小鼠模型中PFC的基因表达谱
途径富集分析揭示了补充Pro调控的信号通路和靶基因
为了进一步阐明基因的功能和主要的分子途径，本文采用了两种互补的信号通路富集方法——KEGG通路富集和GSEA富集分析。分析结果表明，Pro补充调控了ASD小鼠PFC中的多条信号通路，其中氧化磷酸化、神经活性配体-受体相互作用、帕金森病和MAPK信号通路同时在KEGG通路富集和GSEA分析中被显著调节（图8）。
图8 途径富集分析揭示了Pro补充调节的关键信号通路
PPI分析描述了四个关键信号通路中涉及的差异基因的互作网络，8个中心基因是Adcyap1、Bdnf、Th、Trh、mt-Atp6、mt-Atp8、mt-Co2和mt-nd4l（图9）。
图9 Pro补充调控的hub基因分析
Conclusion
综上所述，本研究表明，在VPA诱导的ASD小鼠模型中，补充Pro可以显著减少重复行为和社交功能障碍，缓解ASD样行为障碍。Pro有益作用的潜在机制与肠道菌群功能的改变和PFC转录组谱的改变有关，这表明Pro是一种缓解小鼠ASD症状的潜在干预策略。
第一作者
方靖靖（共同第一作者），女，中国农业大学食品科学与营养工程学院，博士在读，主要研究方向为肠道微生态与孤独症谱系障碍。以第一作者或共一发表SCI一区TOP10文章2篇，发表中文期刊文章1篇。
通信作者
仝涛，韩国延世大学营养学博士（后），中国农业大学食品科学与营养工程学院，副教授（优秀人才），博士生导师。主要从事肠道微生态，孤独症谱系障碍，代谢疾病（如肥胖、肌萎缩）与皮肤光老化的营养干预、作用靶点探究。主持北京市自然科学基金面上项目，山东省自然科学基金青年项目等课题。相关科研成果已经发表在Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Environmental Pollution、Food Froniters、Molecular Nutrition & Food Research、International Journal of Obesity等营养学、医学领域著名学术期刊。以第一作者或通讯作者（含共同）共发表营养学、医学领域SCI论文30余篇，其中JCR Q1类期刊论文17篇，累计影响因子超过200；以通讯作者（含共同）发表中文核心期刊论文19篇；参编营养学相关教材2部。授权发明专利1件，担任 Diabetologia、Food Science and Human Wellness、Molecular Nutrition& Food Research等著名期刊审稿人，《食品安全质量检测学报》、《食品研究与开发》青年委员以及北京食品学会理事、中国营养学会、中国食品科学技术学会、韩国食品营养科学会、韩国食品贮藏流通学会会员。
Dietary L-proline supplementation ameliorates autism-like behaviors and modulates gut microbiota in the valproic acid-induced mouse model of autism spectrum disorder
Jingjing Fanga,1, Ruixuan Genga,1, Seong-Gook Kangb, Kunlun Huanga,c,d, Tao Tonga,c,d,*
a Key Laboratory of Precision Nutrition and Food Quality, Key Laboratory of Functional Dairy, Ministry of Education; College of Food Science and Nutritional Engineering; China Agricultural University, Beijing 100083, China
b Department of Food Engineering and Solar Salt Research Center, Mokpo National University, Muangun 58554, Korea
c Key Laboratory of Safety Assessment of Genetically Modifi ed Organism (Food Safety), Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China
d Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing 100083, China
1 Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
The effective intervention strategy for autism spectrum disorder (ASD) are currently limited. Herein, we attempted to evaluate the potential of L-proline (Pro), a multifunctional amino acid, in ameliorating autism-like behaviors and clarify the molecular mechanisms involved by using the typical valproic acid (VPA)-induced mouse model of ASD. Pro significantly attenuates repetitive behaviors and social dysfunction in ASD mice. The correlation analysis revealed that the beneficial effects of Pro on autism-like behaviors are related to the modulation of gut microbiota structure and composition. The histological analysis revealed that Pro could reverse the decrease of Nissl-positive cells in the prefrontal cortex (PFC) induced by VPA exposure. RNA sequencing demonstrated that Pro can also alter the PFC transcriptomic profile distinguished by the regulation of genes involved in Parkinson disease, neuroactive ligand-receptor interaction, oxidative phosphorylation, and mitogen activated protein kinase signaling pathway. Overall, dietary Pro supplementation may be a promising intervention strategy for ASD.
Reference:
FANG J J, GENG R X, KANG S G, et al. Dietary L-proline supplementation ameliorates autism-like behaviors and modulates gut microbiota in the valproic acid-induced mouse model of autism spectrum disorder[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2889-2905. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250234.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
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