J. Future Foods | 基于代谢组学结合网络药理学探究酸枣仁治疗失眠的活性成分及机制

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Introduction

失眠是一种十分常见的睡眠障碍疾病，其特点是入睡困难、记忆力和注意力下降、睡眠时间减少等。慢性失眠还会产生睡眠质量、抑郁、焦虑、高血压和整体健康问题。失眠症状的全球患病率为8%～40%。近年来，随着生活、工作压力的增加，以及作息不规律的影响，失眠已成为困扰人们生活和健康的主要原因之一。苯二氮卓类药物和安眠药通常被用于治疗慢性失眠，然而这些药物有很多副作用，如药物成瘾、头痛等。此外，其他药物如抗精神病药和抗抑郁药同样具有显着的副作用。中药在历史上一直被用来治疗失眠，且疗效显着，副作用较小。

在我国，酸枣仁（Ziziphi Spinosae Semen，ZSS）在治疗失眠方面有着悠久历史。现代药理研究表明ZSS具有催眠、镇静作用。进一步研究表明，ZSS中的皂苷、黄酮类、生物碱和脂肪酸等对治疗失眠均有良好效果。然而，不同来源、提取方法和工艺的ZSS其化学成分不同，直接影响其镇静催眠作用。因此，评价ZSS在特定技术下的镇静催眠活性、明确其化学成分，进一步揭示其镇静催眠机制十分必要。

LC-MS/MS代谢组学是一种用于中药复杂化学成分分离鉴定的高通量技术，具有灵敏度高、选择性高的特点。该技术可以高效检测萜烯、生物碱、有机酸、氨基酸、脂肪酸等百余种植物化学成分。网络药理学技术可以从大量特定疾病的数据中筛选中药的有效成分和核心疾病靶点。此外，药物成分与疾病靶点之间的调控关系以及药物治疗疾病的机制可以通过网络药理学来阐明。它被广泛应用于探索药物治疗疾病的药理作用和机制、预测药物的活性成分和靶点。在这项研究中，通过动物实验评估了ZSS提取物（ZSSE）的镇静和催眠作用。此外，利用LC-MS/MS分析结合网络药理学研究ZSSE治疗失眠的潜在活性成分、候选靶点和机制。本研究阐明了ZSSE的良好镇静催眠作用，并阐述了其可能的活性成分及作用机制，为ZSS的开发利用提供了理论依据。

Results

ZSSE对小鼠睡眠的影响

巴比妥钠的阈下和阈上剂量

结果显示，腹腔注射巴比妥钠后，100、125、150 mg/kg组小鼠在30 min内均未出现睡眠（表1）。延长30 min后，150 mg/kg剂量组有2 只小鼠入睡，入睡率为20%，80%以上的小鼠未入睡；在200 mg/kg剂量下，仅8 只小鼠入睡，而在250、300 mg/kg剂量下，有10 只小鼠入睡（表1）。因此，根据阈下和阈上剂量的判断标准，本次动物实验中巴比妥钠的阈下剂量为150 mg/kg，阈上剂量为250 mg/kg。

表1 不同剂量巴比妥钠对小鼠的镇静和催眠作用

ZSSE的直接催眠作用

ZSSE对小鼠睡眠的影响见表2。各ZSSE处理组小鼠在60 min内均未出现翻正反射消失的现象。

表2 ZSSE对小鼠直接睡眠的影响

巴比妥钠（阈下剂量）对小鼠的催眠作用

60 min内，PC组小鼠睡眠率达到100%。ZSSE处理组中，HD组效果最好，小鼠睡眠率达到40%；MD和LD组小鼠的睡眠率分别为20%和11%（表3）。

表3 巴比妥钠（阈下剂量）对睡眠小鼠的影响

ZSSE与巴比妥钠的催眠效果

如表4和图1、2所示，与BC组相比，ZSSE处理组所有小鼠睡眠潜伏期的改善无显著性差异，而PC组可缩短小鼠睡眠潜伏期。与空白对照组相比，PC组和ZSSE（HD）组小鼠睡眠持续时间显著延长。而ZSSE（MD）和ZSSE（LD）组对巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间延长无明显影响。

表4 小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间

图1 ZSSE对小鼠睡眠潜伏期的影响

图2 ZSSE对小鼠睡眠时间的影响

ZSSE对小鼠体质量的影响

灌胃给药后，在阈下实验中，ZSSE各剂量组小鼠体质量逐渐下降，其中ZSSE（MD）组小鼠体质量下降幅度最大，BC组和PC组小鼠体质量略有增加。在阈上实验中，各组小鼠体质量均有不同程度下降，其中ZSSE（HD）小鼠体质量下降幅度最大（图3、4）。

图3 巴比妥钠（阈下剂量）诱导小鼠体质量变化

图4 巴比妥钠（阈上剂量）诱导小鼠体质量变化

ZSSE催眠机制的代谢组学和网络药理学研究

ZSSE的有效成分

经LC-MS/MS分析，ZSSE含有200 个化合物，主要包括三萜类和皂苷类、黄酮类及其苷类、生物碱类、有机酸类、脂肪酰基类等成分。

ZSSE治疗失眠的共同靶点

共筛选得到1 036 个基因，与ZSSE生物活性化合物相关的369 个靶点映射到“失眠”，得到116 个共同靶基因（图5）。

图5 与失眠相关的疾病（A）和ZSSE活性成分靶点与失眠相关靶点的交集（B）

活性成分与失眠靶点之间的调控网络

结果可知，ZSSE治疗失眠具有多有效成分、多靶点的特点（图6）。

图6 ZSSE成分-疾病靶点调控网络图

PPI网络与核心靶点

通过Cytoscape软件得到的交互网络有116 个节点和323 条边（图7）。第2个过滤结果为4 个节点20 条边（图8）。

图7 药物-疾病蛋白质相互作用网络

图8 蛋白质相互作用的核心网络

ZSSE治疗失眠的GO和KEGG富集分析

对116 个靶点进行GO富集分析。结果显示，ZSSE的相关靶点富集在1 922 个GO注释，主要涉及类固醇代谢过程、激素水平调节与代谢、突触膜的细胞组成、神经元胞体、血红素结合、突触后神经递质受体活性、神经递质受体活性等BP相关MF。每个部分筛选出GO分析结果前10 位，以P＜0.05为阈值（图9A）。对116 个靶点进行KEGG富集分析显示，靶蛋白分布于类固醇激素生物合成、神经活性配体-受体相互作用、HIF-1信号通路、钙信号通路、多巴胺能突触、cAMP信号通路、胆碱能突触等87 条信号通路。这些经典信号通路在失眠发生、发展中起重要作用。筛选出前30 个KEGG分析结果，以P＜0.05为阈值（图9B）。GO和KEGG分析显示，ZSSE对失眠的治疗作用可能通过多种途径实现。

图9 GO（A）和KEGG（B）富集分析

ZSSE治疗失眠的可能信号通路

本研究采用KEGG Mapper工具获得ZSSE治疗失眠的信号通路图。ZSSE通过类固醇激素生物合成、神经活性配体-受体相互作用、HIF-1信号通路、钙信号通路、多巴胺能突触、cAMP信号通路、胆碱能突触等信号通路参与治疗失眠。如图10所示，HIF-1信号通路至关重要。结果可知，ZSSE可能通过多靶点、多通路治疗失眠。

图10 ZSSE治疗失眠症的主要途径

Conclusion

研究发现，0.25、0.5、1 mg/kg ZSSE（人体推荐剂量的5、10、20 倍）灌胃30 d对小鼠无直接催眠作用，但ZSSE可协同阈下剂量巴比妥钠诱导的催眠作用。其中，1 mg/kg ZSSE显著延长巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，但对缩短巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期无明显影响。

山奈酚、波尔定碱、芹菜素和熊果酸可能是ZSSE治疗失眠的潜在活性成分。此外，AKT1、CAT、PTGS2和HMOX1是治疗疾病的主要关键靶点，主要涉及类固醇激素生物合成、神经活性光受体相互作用、HIF-1、钙、多巴胺能突触、cAMP和胆碱能突触等信号通路。

第一作者

于夏，周口职业技术学院副教授。主要研究方向：药学在医学、护理学中的临床应用及教学，药学校企合作研究等。

通信作者

刘绪强，博士，河南大学校聘副教授，主要研究领域：活性天然产物发现、抗肿瘤药物及作用机制研究、药食两用资源功能成分及功效研究，和保健食品开发。先后主持河南省重点研发与推广专项（科技攻关）项目2 项、河南省博后基金2 项、河南省高等学校重点科研项目1 项，参与国家十四五重点研发计划、河南省重点研发计划等国家及省部级项目多项，在Food Science and Human Wellness、Frontiers in Pharmacology等期刊发表论文10 篇，授权国家发明专利2 项，获得中国商业联合会科学技术奖特等奖、河南省科学技术进步二等奖、第四届三农科技服务金桥奖二等奖等多项奖励。

Exploring the active components and mechanism of Ziziphi Spinosae Semen in treating insomnia by network pharmacology and metabonomics

Xia Yu a, Ziheng Jin b, Linzheng Li b, Jinmei Wang cde*, Changyang Ma cef*, Xuqiang Liu cef*

aZhoukou Vocational and Technical College, Zhoukou 466000, China

bHenan Zhongda Hengyuan Biotechnology Co., Ltd., Luohe 462600, China

cNational R & D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng 475004, China

dFunctional Food Engineering Technology Research Center, Kaifeng 475004, China

eCollege of Agriculture, Henan University, Kaifeng 475004, China

fJoint International Research Laboratory of Food & Medicine Resource Function, Kaifeng 475004, China

*Corresponding author.

Abstract

Insomnia, a sleep-disordered disease, is characterized by difficulty in falling asleep, decrease of sleep quality and sleep time, decline of memory and attention. Ziziphi Spinosae Semen (ZSS) is one of the important “medicine-food” herbs for insomnia and anxiety. In this research, the sedative and hypnotic effects of ZSS extract (ZSSE) was evaluated by animal experiment, and the potential active components and related mechanism were further analyzed by using metabonomics and network pharmacology techniques. The results showed that ZSSE could cooperate with the subthreshold dose of barbital sodium in the hypnotic effect of mice, and the high-dose group (1 g/kg) significantly prolonged the sleep time of mice induced by barbital sodium (P < 0.01). A total of 200 compounds were obtained from ZSSE by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS), including triterpenoids, flavonoids, alkaloids, organic acids, fatty acyls, and among them 113 active components were screened. Network pharmacological analysis indicated that kaempferol, boldine, apigenin and ursolic acid may be the potential active ingredients of ZSSE in the treatment of insomnia. Protein-protein interaction (PPI) networks analysis showed that AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1), catalase (CAT), prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) and heme oxygenase 1 (HMOX1) were the main key targets. Gene Ontology (GO) enrichment analysis showed that these targets were mainly involved in steroid metabolic process, hormone level regulation and metabolism, synaptic membrane, neuronal cell body, heme binding, postsynaptic neurotransmitter receptor activity and neurotransmitter receptor activity. The enrichment analysis of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway showed that the sedative and hypnotic effects of ZSSE might be closely related to signaling pathways such as steroid hormone biosynthesis, neuroactive ligand-receptor interaction, HIF-1 signaling pathway, calcium signaling pathway, dopaminergic synapse, cAMP signaling pathway and cholinergic synapse. This study revealed the potential active components and mechanism of ZSSE in the treatment of insomnia, and provided a theoretical basis for the development and utilization of ZSS.

Reference:

YU X, JIN Z H, LI L Z, et al. Exploring the active components and mechanism of Ziziphi Spinosae Semen in treating insomnia by network pharmacology and metabonomics[J]. Journal of Future Foods, 2025, 5(5): 503-512. DOI:10.1016/j.jfutfo.2024.08.008.

文章翻译由作者团队提供

编辑：龚艺；责任编辑：孙勇

封面图片来源：摄图网

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