随着分辨率的提升，冷冻电镜技术在近些年已经成为了解析蛋白质结构的重要手段。
国家纳米科学中心研究员杨雨荷课题组的主要研究方向是通过结构生物学手段，解析抗原抗体相互作用机制，进而理解免疫系统的应答规律，并以此为指导新型疫苗设计、抗病毒药物开发等课题。
为此，该团队需要使用冷冻电镜对各类不同亚型的病毒抗原和抗体复合物进行三维重构。
为了重构得到高分辨三维模型，研究人员通常需要花费数小时来采集目标样品照片，从照片中挑选出近百万个蛋白质颗粒并进行平均，才能达到消除噪声、提高分辨率的目的。
人们很难分辨单个颗粒属于哪种复合物，尤其是不同病毒亚型的形貌差别很小，因此同一个电镜载网上仅能同时搭载一种确定类型的复合物。
对于变种极多的病毒抗原，和免疫系统产生的大量不同种类的抗体而言，对它们的复合物进行逐个数据采集需要耗费大量的人力和时间。
基于这一背景，杨雨荷课题组提出了 DNA 纳米标签的概念。利用可编程组装的 DNA 纳米结构作为具有特殊形状的标记物，标记每种复合物颗粒的种类信息，使得数据处理算法能够根据 DNA 纳米标签的形状对蛋白颗粒进行自动分类，实现同一个电镜载网上搭载多种不同类型的复合物。
这种多路成像的理念能够极大地提高电镜表征的通量，加速病毒抗原和抗体复合物的筛选和表征。
冷冻电子断层成像是目前冷冻电镜技术发展的新兴领域。这一技术通过对一个特定区域进行不同倾转角度连续拍照，实现目标三维模型重构的目的。
相比于传统冷冻电镜技术，冷冻断层成像可以用于对细胞内原位结构的表征，更能反应蛋白质复合物在细胞内的真实状态。
然而，由于需要对目标连续拍照，每张照片的电子剂量又受到了进一步的限制，照片信噪比相比传统技术更低。除此之外，细胞内环境充满了各类复杂的蛋白质，这进一步使得目标颗粒的识别和定位变得更加困难。
面对这一挑战，杨雨荷团队认为衬度强、尺寸大、形状特异性高的 DNA 纳米标签有望在细胞原位精确指示目标颗粒位置，成为分析细胞原位环境中蛋白颗粒的重要工具。
日前，相关论文以《用于多路单粒子电子显微镜和原位电子冷冻断层扫描的 DNA 纳米标签》（DNA Nanotags for Multiplexed Single-Particle Electron Microscopy and In Situ Electron Cryotomography）为题发在JACS Au[1]，该团队博士生陈远方、黄一倩是第一作者，杨雨荷担任通讯作者。
图 | 相关论文（来源：JACS Au）
总的来说，本次工作探索了 DNA 纳米标签在辅助电镜成像上的可能性。相关论文讨论了 DNA 纳米结构作为纳米标签的三项优势。
其一，DNA 纳米结构是一种高度可编程的结构，利用现有的技术可以在纳米尺度精确设计出任意形状的纳米结构。
其二，目前已经有大量论文证明，DNA 纳米结构可以很简单地修饰不同的蛋白质及其他功能分子。
其三，DNA 纳米结构也被证明具有一定的稳定性，至少在冷冻制样的时间尺度内可以保持自身结构的完整性。
在多路电镜成像中，本次论文认为 DNA 纳米标签可能会对蛋白颗粒的信号造成干扰。为此，本次论文讨论了去除这种信号干扰的可能方法，包括在设计上拉远 DNA 和蛋白之间的聚集，以及使用算法削弱 DNA 结构的信号等。
在原位成像方面，DNA 纳米结构如何进入细胞，并在细胞中迁移并最终到达目标位点是一项重大的挑战。因此，本次论文着重论述了目前可能的实现方法，包括利用细胞跨膜运输通道、直接跨膜递送、原位表达 RNA 纳米结构等可能的实现手段。
DNA 纳米标签在活细胞中的原位蛋白质的标记的实现，目前急需解决的是高效递送和胞内迁移的问题。杨雨荷表示：“在推进这一概念实现的过程中，我认为我们应该采用“先通后优”的策略。先通过对现有的技术和成果的整合，在初期阶段保证基本功能的实现。在验证核心功能和路径有效后，再进行优化效率、提高普适性的探索”
她继续说道：“因为尽管我们已经做了尽量全面的设想和分析，有合理的论据作为支撑，但实践的过程中往往还会遇到新的问题。目前来说，针对 DNA 纳米标签原位标记蛋白质用于结构解析这一目的，我们已经在开展试验进行探索。”
基于细胞冷冻断层成像技术的标准化流程，通过聚焦离子束技术，他们从细胞中减薄得到一个 100nm-200nm 厚的“小薄片”，但是不能精准定位到细胞中感兴趣的区域，这也使得下一步在减薄得到的“小薄片”中定位纳米尺度的蛋白质结构提高了难度。
基于此，课题组认为首先应选择在细胞中丰度较高的蛋白质作为目标模版，进行 DNA 纳米标签方法的探索。
另一方面，细胞内的内质网的膜结构在电子显微镜下具有较好的衬度，具有“电镜低倍下可分辨性”。
综上，如果以内质网上丰度较高的蛋白质作为 DNA 纳米标签的标记目标，可以通过 DNA 纳米结构与内质网的“共定位”判断 DNA 纳米标签的功能性，同时证明胞内迁移这一问题是可以克服的。
由此，再进一步聚焦于探究 DNA 纳米标签挑选蛋白质的重构策略，最终实现活细胞内原位蛋白结构的解析。
在 DNA 标签的功能已经得到验证之后，最后还需要从成本、简便性和普适性的角度进一步优化，为制备细胞原位蛋白结构解析颗粒挑选的“通用型”试剂盒提供基础。
归根结底，DNA 纳米标签技术是探索细胞内蛋白质在原位状态下结构的工具。课题组探索的最终目的是通过 DNA 纳米标签的辅助，利用冷冻断层成像技术对蛋白质的结构进行解析，进一步认识和理解蛋白质发挥功能的机制，研究其构效关系，为人类改造自然和人工制造提供思路指导和借鉴。
总之，其所使用的工具是时有更迭的，是基于现有的成果和技术开发的一种探究手段，但对生命体机制的探索是永恒的话题。
下一步，他们计划先设计不同形状的 DNA 纳米结构，分别标记同一种病毒的不同抗原亚型，与抗体结合后使用电镜观察。验证这种策略能否有效识别蛋白颗粒种类，并希望能够重构得到正确的抗原抗体结合信息。
参考资料：
1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.4c00986
运营/排版：何晨龙
