药学1区 | 甘草泻心汤通过抑制ACSL4介导的铁死亡减轻实验性结肠炎

【写在前面】：本期推荐的是由梅州医学科学院、梅州人民医院等研究团队近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示甘草泻心汤通过抑制ACSL4介导的铁死亡减轻实验性结肠炎。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Gancao Xiexin decoction attenuated experimental colitis through suppressing ACSL4-mediated ferroptosis

民族药理学相关性：甘草泻心汤（GCXXD），由甘草、半夏、黄芩、生姜、人参、黄连、大枣组成，是一种用于治疗溃疡性结肠炎（UC）的传统中药方剂。然而，GCXXD治疗UC的潜在机制尚未完全阐明。

研究目的：溃疡性结肠炎是一种以肠道屏障破坏为特征的慢性胃肠道炎症性疾病。先前的研究表明，肠上皮细胞（IECs）中过度激活的铁死亡会加重结肠的损伤和局部通透性异常。铁死亡的主要机制之一是脂质过氧化物，其依赖于长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）来合成膜磷脂。最近的研究结果表明，GCXXD通过保护肠道黏膜屏障显著减轻了溃疡性结肠炎（UC）的症状。因此，我们旨在证明GCXXD的药理机制与ACSL4介导的铁死亡有关。

材料与方法：在这项研究中，我们评估了GSE134025数据集，并建立了由DSS诱导的结肠炎实验模型，用20 mg/kg的ACSL4抑制剂（罗格列酮）进行治疗。通过结肠病理改变和阿尔西蓝染色（用于显示组织或细胞样本中的酸性黏多糖 <如硫酸软骨素、硫酸角质素等> 及其他黏液物质）来证实ACSL4抑制作为UC的潜在治疗方法。随后，我们检查了GCXXD（9、12、15 g/kg）治疗后UC小鼠的疾病症状、肠道黏膜修复和铁死亡标志物。结肠组织的转录组研究揭示了GCXXD在治疗UC方面的潜在机制。最后，我们在治疗UC时联合使用ACSL4上游激动剂和GCXXD，以证明GCXXD通过调节ACSL4诱导的铁死亡来减少UC的炎症。

结果：通过GSE134025数据集分析，我们发现ACSL4在UC患者中显著表达，其抑制剂成功减轻了UC结肠的临床症状。此外，我们发现GCXXD改善了结肠长度和体重，同时增加了黏蛋白（Mucin）、闭合蛋白（Occludin）和Claudin-1的表达。它还降低了结肠炎症细胞浸润以及IL-1β和TNF-α的水平。与此同时，GCXXD有效降低了结肠炎小鼠中与铁死亡相关的指标，如丙二醛（MDA）、Fe²⁺、COX2和ACSL4，同时上调了GPX4的表达。通过对3% DSS和GCXXD治疗组之间差异表达基因进行KEGG分析，我们发现了GCXXD治疗与Hippo信号通路、花生四烯酸代谢之间的重要联系。由于TEAD4作为ACSL4的上游转录因子，我们在治疗UC时联合使用GCXXD和YAP激动剂Py-60。值得注意的是，当激活ACSL4上游通路时，GCXXD对肠道黏膜损伤和铁死亡的抑制作用减弱。

结论：甘草泻心汤通过TEAD4/ACSL4通路减轻UC中的铁死亡。

（图文摘要）

【前言】

溃疡性结肠炎（UC）是一种持续性的非特异性胃肠道炎症性疾病，主要影响乙状结肠和直肠。目前，肠道黏膜完整性受损已被认为是UC的基础病理生理机制，也是患者中主要的难治性因素。由于UC中的持续炎症会直接破坏上皮细胞的紧密连接结构，病原菌可以穿过受损的黏膜组织并刺激免疫细胞，从而导致肠道炎症加剧。机体对肠道损伤的反应涉及肠上皮细胞（IECs）的丢失和再生。然而，这一机制并不能解决UC患者黏膜损伤的修复问题。根据研究，在UC中发现了异常的程序性细胞死亡，导致肠道损伤增加和局部通透性问题。

铁死亡是一种最近被识别的程序性细胞死亡形式，它在特定病理状态下导致激活细胞的选择性清除，并与多种胃肠道疾病密切相关。临床研究发现，溃疡性结肠炎患者在肠上皮细胞中表现出铁死亡的特征性形态，如线粒体收缩。而使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1已被发现能成功预防UC小鼠的溃疡形成。脂质过氧化物的形成在铁死亡的发展中起着关键作用，其敏感性与脂质代谢密切相关。研究表明，缺乏长链酰基辅酶A合成酶家族成员4（ACSL4）表达的细胞即使在GPX4被敲除的情况下也能保护自己免受铁死亡的影响。ACSL4催化产生花生四烯酰辅酶A和肾上腺酰辅酶A，这些物质通过LPCAT3重新酯化成类似于PE的磷脂，从而增强铁死亡的敏感性。最近的研究显示，UC患者结肠黏膜中ACSL4表达升高，而降低ACSL4水平已被证明可以缓解症状并预防UC动物的铁死亡。靶向或降低ACSL4的转录活性作为干扰肠道铁死亡和恢复肠道完整性的治疗方法具有潜力。

作为一种传统中药，甘草泻心汤（GCXXD）多年来常被用于治疗包括结肠炎在内的胃肠道疾病。根据研究，GCXXD在缓解或消除临床症状、提高结肠病理改善以及展示更高的治愈率和更低的复发率方面优于美沙拉嗪。GCXXD可以通过调节免疫功能来降低UC患者中促炎因子IL-6和IL-17的水平。最近的研究表明，GCXXD通过维持肠道黏膜屏障稳态对UC具有显著的治疗效果，但其机制尚不清楚。因此，对其在治疗UC中的具体作用机制进行更多研究是必要的。鉴于铁死亡在肠道黏膜损伤中的重要性，我们推测抑制铁死亡可能是GCXXD在UC治疗中产生疗效的机制之一。本研究将以ACSL4介导的铁死亡为切入点，探讨其作为UC的潜在治疗靶点，并以GCXXD为例，为解决UC的黏膜愈合问题提供新的思路。

【结果】

3.1. ACSL4介导的铁死亡参与UC发生发展

我们对比UC患者和正常组织的转录组数据（GEO登录号：GSE134025）后发现，UC患者中ACSL4及其他铁死亡关键基因表达上调（图1A和B）。同时，我们用ACSL4抑制剂罗格列酮（Doll等人，2017年）干预DSS诱导的UC小鼠，发现该抑制剂可有效恢复UC小鼠的结肠长度（图1C），缓解体重减轻（图1D）和结肠组织溃疡（图1E），并增加小鼠结肠上皮细胞的黏蛋白分泌（图1F）。这表明，靶向ACSL4介导的铁死亡可能是治疗UC的潜在策略。

3.2. GCXXD缓解DSS诱导的结肠炎小鼠的病理指标和组织损伤

既往研究表明GCXXD对UC患者有治疗作用。本研究中，我们首先用液相色谱-质谱联用法对GCXXD中的化学成分进行鉴定，发现其中含有多种主要活性成分，包括甘草素、黄芩素、人参皂苷Rg1、小檗碱、甘草苷元、氧化苦参碱、异甘草苷元和姜黄素（图2A），补充材料（补充文件1）中有详细数据。此外，我们采用3% DSS建立UC实验模型，同时给予GCXXD治疗。11天后，3% DSS模型组的结肠缩短程度明显大于正常组，而GCXXD给药改善了结肠长度（图2B），缓解了小鼠的肠道出血和腹泻等症状（图2C），减轻了结肠炎引起的体重减轻（图2D）。苏木精-伊红染色的组织学检查显示，3% DSS处理的小鼠结肠炎严重，表现为上皮脱落和多形核白细胞浸润到结肠固有层，而GCXXD治疗似乎成功改善了这些症状（图2E）。

3.3肠道黏膜的慢性炎症可直接破坏上皮紧密连接结构。本研究发现，GCXXD可降低血浆中TNF-α、IL-1β等炎症因子含量（图3E和F），同时上调TGF-β（图3G），还能恢复结肠组织中闭合蛋白、紧密连接蛋白1和黏蛋白的表达（图3A-D）。

3.4. GCXXD减少ACSL4相关的铁死亡发生

铁死亡的过度激活对UC的黏膜组织愈合过程有显著的不良影响。我们的实验结果显示，UC小鼠血清中丙二醛（图4F）和COX2（图4G）等铁死亡标志物升高，但GCXXD治疗可有效降低这些标志物。此外，GCXXD减少结肠中Fe²⁺含量（图4A和B），抑制ACSL4表达并恢复UC小鼠结肠中GPX4蛋白水平（图4C-E）。

3.5.GCXXD通过可能与Hippo信号通路相关的机制减少铁死亡

为了探讨GCXXD治疗UC与铁死亡之间的联系，我们收集了正常组、3% DSS组和高剂量GCXXD组的结肠组织进行转录组分析。通过KEGG分析3% DSS组和GCXXD治疗组之间的差异表达基因，我们发现GCXXD治疗UC与铁死亡、花生四烯酸代谢和Hippo信号通路之间存在联系（图5A-C）。有趣的是，GCXXD降低了结肠中ACSL4（图5D）和TEAD4（图5E）mRNA的表达。随后，我们利用GEPIA数据库研究了这两个基因之间的相关性，结果表明ACSL4和TEAD4之间存在正相关关系（图5F）。此外，结肠蛋白检测数据显示，GCXXD减少了结肠炎动物中ACSL4上游Hippo信号通路的激活（图5G和H）。

3.6.GCXXD通过TEAD4/ACSL4通路减少铁死亡

在这项研究中，我们使用YAP激动剂Py-60与GCXXD联合应用，以在UC小鼠中验证转录组学研究结果。联合使用YAP激动剂和GCXXD降低了其在UC中的治疗效果，表现为结肠长度和体重的恢复有限（图6A和B）、血清TNF-α和MPO水平降低（图6D和E）以及组织学指标改善（图6C）。此外，激活Hippo信号通路，如活性YAP1进入细胞核或TEAD4表达升高（图7A和B），限制了GCXXD对铁死亡的抑制作用。联合治疗组并未降低结肠组织中的Fe²⁺（图6F）和ACSL4水平，也未提高GPX4表达（图7C-E）。这些数据表明，GCXXD通过TEAD4/ACSL4通路抑制铁死亡。

溃疡性结肠炎是一种慢性、易复发的肠道炎症性疾病，其特征是持续的炎症、广泛的溃疡和结肠黏膜的破坏。根据流行病学研究，大约三分之一的重度UC患者会出现原发性硬化性胆管炎、坏死性皮炎、静脉血栓等并发症。由于其“炎症”特性，UC的研究大多集中在免疫治疗策略上，如抗TNF-α抗体等生物制剂的开发。尽管这些药物在短时间内改变了UC的治疗格局，但仍有一小部分患者对现有治疗反应不佳。因此，了解UC的病理生理学并开发更有效的治疗方法仍然是一个重要的科学问题。

UC发病早期以肠道屏障破坏和黏膜稳态丧失为特征。临床研究表明，成功的肠道黏膜修复有助于症状改善、降低手术风险，并且是UC患者药物治疗的重要预后指标。肠道黏膜由四种上皮细胞组成：柱状细胞、潘氏细胞、杯状细胞和神经内分泌细胞。柱状细胞构成肠道上皮的绝大部分，其腔面有微小指状突起，称为微绒毛，被糖萼层包围。这种黏液单层起到物理屏障的作用，防止腔内致病菌进入肠道黏膜。一旦肠道屏障的完整性受损，大量肠道细菌会穿过肠道上皮屏障，导致免疫系统过度激活和异常的免疫及炎症反应。因此，这会破坏肠道黏膜免疫微环境的稳态，最终促进溃疡性结肠炎的发展。因此，修复受损的肠道黏膜已被公认为UC治疗的关键。

甘草泻心汤（GCXXD）是一种中药方剂，对UC的黏膜损伤具有预防作用。然而，其确切机制尚不清楚。GCXXD由甘草、半夏、黄芩、生姜、人参、黄连、大枣组成。这些植物名称已在药用植物名称服务（MPNS）（http://mpns.kew.org）中得到验证。在这项研究中，我们使用高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）鉴定了GCXXD中的典型物质，如甘草素、黄芩素、人参皂苷Rg1、小檗碱、氧化苦参碱和姜黄素。然后我们建立了DSS诱导的UC模型，以评估GCXXD对UC小鼠的治疗效果。结果表明，GCXXD不仅改善了UC症状，如体重减轻、结肠缩短和组织溃疡，还恢复了紧密连接蛋白Occludin、Claudin 1和Mucin的表达。这些表明GCXXD对肠道损伤具有很强的修复作用。值得注意的是，肠道上皮细胞的更新速度是最快的，有助于肠道损伤的愈合。同时，调节性T细胞（Treg）、固有淋巴样细胞（ILCs）和巨噬细胞衍生的细胞因子，如IL-10、IL-22和TGF-β，可以促进肠道上皮细胞的黏液分泌和RegIIIβ、RegIIIγ抗菌肽的表达，并诱导肠道干细胞的增殖，通过信号传导增强屏障修复。尽管如此，黏膜修复在UC中仍然是一个问题，可能是因为上皮损伤未能成功缓解或预防，从而加剧了肠上皮细胞（IEC）的脱落。

临床研究表明，错误或过量补充铁可能会增加UC恶化的风险。通常认为铁可以通过芬顿反应导致活性氧（ROS）积累，从而引发脂质过氧化。脂质过氧化物的分解会产生4-羟基壬烯酸和丙二醛，这可能导致细胞膜中蛋白质和核酸的异常共价改变，从而激活细胞的铁死亡机制。此外，研究人员发现，经历铁死亡的IEC会产生如HMGB1等损伤相关分子模式，这会显著激活先天免疫系统，增加IEC脱落和肠道高通透性。抑制铁死亡可能有助于UC动物肠道黏膜完整性的恢复，这表明过度的铁死亡激活可能是肠道损伤修复的重要障碍。在这项研究中，我们发现GCXXD可以成功降低UC小鼠中铁死亡标志物如Fe²⁺、COX2和MDA的含量。此外，转录组分析结果也证明了GCXXD治疗UC与铁死亡有关。因此，我们希望继续研究GCXXD抑制铁死亡的可能机制。

谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）途径是调节铁死亡的公认机制。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的作用是将磷脂链产生的脂质过氧化物还原为脂质醇，从而降低肠道上皮细胞对铁死亡的敏感性。研究表明，上调GPX4表达可以改善UC小鼠的结肠组织学损伤。脂质过氧化被认为是脂质代谢中的特异性过程，细胞脂质和脂质代谢在铁死亡的调节中起着关键作用。作为铁死亡的信号脂质，PE-AA和PE-AdA的合成从脂肪酸酰基化开始。长链酰基辅酶A合成酶家族成员4（ACSL4）将辅酶A连接到多不饱和脂肪酸（PUFA）如花生四烯酸（AA）及其衍生物腺苷二磷酸（AdA），然后在溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3）的催化下与膜磷脂结合。PE过氧化产生的脂质自由基，包括磷脂过氧化自由基（PLOO•），引发脂质过氧化链反应，最终导致铁死亡。ACSL4已被确定为铁死亡的关键基因，ACSL4介导的脂质代谢已成为铁死亡的重要靶点。在回顾GSE134025的数据集后，我们发现ACSL4在UC患者的黏膜中表达显著，ACSL4抑制剂在UC动物中有效。这表明，靶向ACSL4介导的铁死亡可能是治疗UC的一种可行方法。

蛋白质分析结果显示，GCXXD可能会显著抑制结肠中ACSL4的表达。最近的研究发现，ACSL4产生的膜脂质可以抑制GPX4的表达，促进肾细胞的铁死亡。而GCXXD对GPX4的表达有有益影响。进一步研究GCXXD和3%DSS组之间的差异基因表达表明，GCXXD治疗UC可能包括激活Hippo信号系统。由于没有ACSL4激动剂，而TEAD4是ACSL4的上游转录因子，我们使用YAP激动剂Py-60与GCXXD联合治疗UC小鼠。有趣的是，通过激活Hippo通路增加ACSL4表达时，GCXXD的治疗效果及其对UC的铁死亡抑制作用被削弱。尽管本研究的结果已经表明GCXXD通过抑制ACSL4介导的铁死亡有效治疗UC，但需要考虑潜在的药物脱靶效应。因此，目前正在进行更严格的实验，例如通过重组腺相关病毒将ACSL4/TEAD4基因递送到肠道上皮细胞中。

【结论】

目前的研究已经证明，GCXXD通过抑制ACSL4介导的铁死亡来治疗溃疡性结肠炎，恢复肠道上皮细胞的正常脱落和再生，并促进肠道黏膜屏障的自我修复（图8）。