本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。
Introduction
牛奶过敏（CMA）是婴幼儿最常见的食物过敏之一，人群中约有2%～6%的婴幼儿和2%的成年人会发生牛奶过敏。CMA的常见症状包括过敏性皮肤炎、哮喘和胃肠道疾病，在极端情况下会发生危及生命的过敏反应。CMA是一种IgE介导的反应，由特异性IgE抗体识别抗原触发，随后导致肥大细胞或嗜碱性细胞脱颗粒，并释放组胺和白三烯等促炎介质。目前，大多数牛奶蛋白已被报道具有潜在的致敏特性，最常见的过敏原是酪蛋白（α-、β-和κ-酪蛋白）和乳清蛋白，包括β-乳球蛋白（β-Lg）、α-乳白蛋白、血清白蛋白（BSA）和免疫球蛋白。其中，β-LG在乳清蛋白部分占主导地位（50%），是公认的主要牛奶过敏原，在牛奶敏感人群中引起严重反应。目前，治疗CMA最有效的方法是完全避免饮食中的相关食品成分，这可能导致儿童营养不良和影响生长的情况，特别是在幼儿期。因此，研究人员一直在探索热处理和非热处理方法，包括热处理、酶和非酶糖基化、蛋白水解、高压处理及超声处理等。这些方法通过改变牛奶过敏原蛋白的结构，能够缓解牛奶过敏（CMA）。然而，尽管某些处理在不同程度上降低了牛奶蛋白的致敏性，但使用酶或热处理会导致产品质量的下降，特别是蛋白质变性、低功能和风味变差。对于非热技术，如超声和静水压力，所涉及的结构-致敏性关系不明确，因此加工后的蛋白质在残余致敏性上表现出各种变化。
近年来，大量文献报道多酚具有与牛蛋白相互作用诱导构象变化的能力，从而改变了复合蛋白的功能、营养和生物学特性。酚类化合物改变蛋白质理化特性的能力与其分子结构密切相关，如分子大小、疏水性、结构柔韧性、官能团的存在等。最近，一些研究表明，多酚与牛奶过敏原的络合可以通过屏蔽或改变抗原表位来降低牛奶过敏原的致敏性，这为开发具有健康有益特性的低致敏性牛奶基质提供了一条可行的途径。来自常见植物源（如茶、可可和葡萄）的多酚，被证明可以降低牛奶过敏原（包括β-LG和BSA）的IgE结合能力。此外，一些纯酚类化合物，如咖啡酸、绿原酸和（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）已被报道通过与牛奶中致敏蛋白/部分的非共价或共价相互作用来缓解CMA。有研究报道了β-LG与茶黄素、绿原酸和飞燕草素-3-葡萄糖苷的非共价相互作用显示，由于多酚直接模糊了β-LG的线性表位，因此IgE结合水平降低。最近，证实了六种黄酮类化合物结合到β-LG的表位区域，并在一定程度上导致复合物的IgG结合能力下降。在这种情况下，多酚的化学结构被认为是其对β-乳球蛋白（β-LG）致敏性可变影响的原因。然而，目前鲜有研究探讨多酚的结构与其对β-LG低过敏性之间的关系。此外，由于表位区域与蛋白质的构象结构密切相关，因此β-LG与多酚复合物的构象变化与其致敏性之间的关系也值得深入研究。
因此，本研究旨在探讨非共价条件下多酚与β-LG致敏性的结构-致敏性关系。选择具有不同多酚成分的不同植物源制备β-LG配合物;鉴定了与β-LG结合的优势酚类化合物，并通过多种光谱和免疫学方法研究了它们对β-LG结构和致敏性的影响。本研究将为多酚相互作用和减轻典型牛奶过敏原的致敏性提供新的见解，为CMA的解决提供理论和实践支持。
Results and Discussion
五种富含植物多酚的提取物是降低β-LG致敏性的潜在物质
不同植物提取物中总酚、总黄酮和花青素的含量
选择八种植物材料作为多酚的来源:黑果枸杞、蓝莓、草莓、黑莓、李子、紫胡萝卜、葡萄和黑大豆。选择这些植物是因为它们含有丰富的多酚，但成分不同，能够比较各种多酚降低牛奶过敏原的致敏性的能力。首先测定各富多酚提取物的TPC、TFC、TAC含量，见表1。BSE中TPC和TFC值最高，分别为69.7和27.1 mg/g。BSE中的花青素含量最高（27.2 mg/g），其次是LRE（20.4 mg/g）、BE（7.0 mg/g）和BBE（6.8 mg/g）。在另一项研究中，蓝莓、黑大豆和黑果枸杞的提取物也被证明在14种植物来源中含有相对较高的多酚和花青素。具体数值的变化可归因于样品收集和分析方法的差异。
表1 不同植物多酚提取物的TPC、TFC和TAC值
β-LG提取复合物的致敏性评价
为了选择可能降低β-LG致敏性的植物来源，每种提取物在上述非共价条件下制备β-LG-多酚复合物。CMA主要被称为IgE介导的应答，而IgG也参与免疫识别复合物的形成。也有报道称，CMA患者表现出高水平的循环抗原特异性IgG，同时抗原特异性IgE水平升高。鉴于此，对各复合物的IgE和IgG结合能力进行了评估，结果如图1A-B所示。根据IgE结合水平，在较低的β-LG：提取物质量比为1:1时，只有PCE和BSE能够略微降低β-LG的致敏性（P＜0.05），而在较高的质量比为1:2时，BE、SBE、BBE、PCE、CE和BSE等五种提取物使β-LC的IgE结合能力降低了4.8%-16.2%（P＜0.05）。与IgE结合试验的结果不同，当与β-LG以1:1～1:5的质量比复合时，所有提取物都抑制了β-LG的IgG结合能力5.2%～59.7%。β-LG-BSE复合物的致敏水平最低，分别使β-LG的IgE和IgG结合能力降低了16.2%和59.7%。β-LG-提取物复合物的IgE和IgG结合率的差异可能是由于抗原特异性IgE和IgG的不同结合表位造成的。结果还表明，CMA患者血清中的IgG对β-LG的构象表位具有明显的结合倾向。考虑到不同提取物的酚类成分及对β-LG的IgE-和IgG结合水平的抑制作用，选择LRE、BE、SBE、BBE和BSE 5种植物提取物，以蛋白:提取物质量比为1:1的比例与β-LG配合物进行进一步实验。
图1β-LG提取物复合物致敏特性的变化
β-Lg萃取物复合物对肥大细胞的致敏性
在食物过敏的效应期，摄入的食物过敏原与肥大细胞和嗜碱性细胞表面的特异性IgE结合，触发细胞脱颗粒，释放活性介质，如β-己糖氨酸酶和组胺，可在短时间内诱发急性过敏症状。因此，肥大细胞脱颗粒试验被广泛用于评估过敏原的体外致敏性，其结果被证明与临床过敏表现密切相关。在本研究中，利用LAD2人肥大细胞刺激后的β-己糖氨酸酶释放率，评估了不同β-LG提取物复合物触发肥大细胞脱颗粒的能力。结果如图1C所示。与阳性对照相比，所有β-LG萃取物复合物的β-己糖氨酸酶释放率均较低，但只有β-LG-BBE复合物的脱粒程度降低了9.07%（P＜0.05）。需要注意的是，肥大细胞脱颗粒和IgE/IgG结合能力试验结果存在差异。这可能是由于肥大细胞除受IgE的刺激外，还可受IgG、TLR配体、神经肽、细胞因子等的刺激而脱颗粒。
β-LG提取物复合物中结合多酚的表征
多酚与膳食蛋白质的结合特性可能受到多酚分子结构的影响，如分子量（MW）和侧链基团（如甲基化、羟基化和氢化）。在蛋白质-酚络合体系中，大多数多酚可能以游离形式存在，只有与蛋白质结合的多酚才能承受形成的络合物的结构变化。本研究对5种植物提取物LRE、BE、SBE、BBE和BSE与β-LG络合前后的酚类成分进行了分析，以表征不同配合物中与β-LG相互作用的优势多酚。结果如表2所示。根据计算出的各组分结合率，根据以下标准筛选出11种酚类化合物：1）复合物中保留的量相对较高；2）原始提取物中的高浓度；3）纯化合物的商业可用性。所选分子可分为4个亚组，包括1）黄酮醇：槲皮素和芦丁；2）黄烷-3-醇：（+）-儿茶素和（-）-表儿茶素；3）花青素和单宁：C3G、PB2和鞣花单宁；4）酚酸：绿原酸、对香豆酸、咖啡酸和鞣花酸。另外三种化合物，即杨梅素、矢车菊素和EGCG，由于其结构与上述化合物之一相似，也被包括在内。在进一步的实验中，分析了这14种纯酚类物质对β-LG结构和致敏性的单独影响。所选酚类化合物及其指定基团的化学结构见图2。
表2 不同配合物中优势多酚与β-LG结合比率的测定
图2 所研究的酚类化合物的化学结构及其归属基团
纯β-LG多酚配合物的理化性质及结构性质分析
粒径和ζ电位
首先分析了β-LG-纯多酚复合物的理化特性，包括颗粒行为、可溶性蛋白质水平和表面疏水性。如图3所示，与对照组相比，大多数复合物的绝对ζ电位值增加（P＜0.05），表明多酚的引入增强了系统的胶体稳定性。这可归因于带负电荷的多酚对一些带正电荷的蛋白质基团的中和，这增加了悬浮颗粒之间的静电排斥。β-LG-鞣花酸复合物的ζ电位绝对值低于对照组（P＜0.05）。粒径分布曲线进一步表明，天然β-LG具有典型的单峰分布模式，而与多酚结合时，则出现多峰分布，出现较大的颗粒聚集，平均粒径逐渐增大。这进一步表明形成了含有较大粒径团聚体的次稳定体系。
图3 不同β-LG纯酚配合物的粒径分布和ζ电位
可溶性蛋白含量和表面疏水性
表面疏水性与疏水性氨基酸在蛋白质表面的分布密切相关，这在一定程度上反映了蛋白质的结构和功能特性。同时，多酚可能与涉及疏水区域的蛋白质相互作用，导致复合物的理化性质发生变化，特别是蛋白质的溶解度。如图4所示，与天然β-LG相比，与杨梅素、EGCG和鞣花单宁结合可增加系统中的可溶性蛋白浓度（P＜0.05）。有趣的是，β-LG-杨梅素/EGC/鞣花单宁复合物的H0值均显著低于天然对照（P＜0.05）。除β-LG鞣花酸系统的H0水平较低外，其他两组在两个指标上均无显著差异（P＞0.05）。与（+）-儿茶素和（-）-表儿茶素相比，EGCG的连接没食子酸部分可能有助于其与β-LG的结合亲和力。黄酮醇环B上的羟基化被证明可以增强其与乳蛋白的结合能力，这可能有助于解释β-LG-1中观察到的较低H0值杨梅素复合物。可溶性蛋白含量与H0值呈负相关（r＝-0.728，P＜0.01），具有较高表面疏水性的蛋白质通常对疏水力具有天然聚集潜力，因此导致低水溶性。
图4β-LG与不同酚类化合物络合后可溶性蛋白水平和表面疏水性指数的变化
蛋白质结构改变
荧光光谱是研究蛋白质与小分子（如酚类化合物）相互作用最广泛的方法之一。在280 nm处激发时，蛋白质的固有荧光主要由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基贡献。如图5所示，与天然对照相比，所有β-LG纯多酚复合物的固有荧光信号均下降，这意味着多酚与β-LG的相互作用影响了蛋白荧光团的微环境。值得注意的是，鞣花单宁对β-LG固有荧光的猝灭作用最大，其次是EGCG、杨梅素和对香豆酸。在非花青素类黄酮中，杨梅素和EGCG的猝灭率高于其他结构相关化合物。此外，EGCG的分子量大于黄酮类化合物中的其他化合物，并且鞣花单宁的分子量最大（1087 Da），对β-LG的固有荧光显示出最高的淬灭能力。
图5β-LG与不同酚类化合物配合的荧光发射光谱
利用CD光谱对β-LG纯多酚配合物的二级结构进行表征，结果如图6所示。最大负峰强度的变化和不同程度的红蓝偏移表明，多酚结合诱导了β-LG二级结构的变化。进一步计算各配合物的二级结构组成，以堆叠柱状图表示，如图6B所示。结果表明，与不同多酚相互作用后，β-LG中α-螺旋的含量随着β-折叠比例的扩大而不同程度地下降。相比之下，β-转角和随机线圈的含量在不同络合物中的分布存在差异。通过相关分析，α-螺旋和β-折叠的比例之间存在较强的相关性（r＝-0.732，P＜0.05），表明配合物从α-螺旋向β-折叠转变。上述结果表明，选择的多酚与β-LG之间的相互作用诱导了蛋白质构象的各种变化，这可能进一步引起某些免疫活性表位的结构和可及性的改变。
图6 （A）CD光谱和（B）计算出的β-LG与不同酚类化合物的二级结构组成
纯β-LG多酚复合物的致敏性评价
最后分析了这些复合物的致敏性。如图7A所示，所有β-LG纯多酚复合物都不同程度地降低了IgG结合能力。β-LG-鞣花丹宁复合物抑制率最高，为38.1%，其次为β-LG-EGCG复合物，抑制率为25.3%，其余复合物组抑制率为14.2%～21.2%。如上所述，鞣花单宁属于单宁家族，EGCG是黄烷-3-醇的一种；这两种化合物都具有高分子量，这可能有助于它们通过多个活性位点与β-LG的多肽链相互作用，包括位于蛋白抗原表位附近或内部的残基。此外，CD光谱结果显示，β-LG-鞣花单宁/EGCG复合物二级结构组成变化最为显著（图6B），再次证实特异性多酚结合诱导β-LG发生明显构象变化，进一步导致β-LG致敏性降低。以大量的蛋白结合鞣花单宁和PB2为特征，可以部分解释BBE和BSE在降低β-LG的IgG结合能力方面的较好效果（图1B）。
还进行了肥大细胞脱颗粒试验，结果如图7B所示。考虑到肥大细胞脱颗粒与ELISA试剂盒相比的生理相关性，这里没有进行IgE结合测定。与IgG结合能力的数据不同，芦丁、杨梅素、矢车菊素、C3G和几乎所有四种酚酸都能在统计学上缓解β-LG诱导的肥大细胞脱颗粒（P＜0.05）。值得注意的是，IgG结合抑制率最高的鞣花单宁（图7A）对β-己糖胺酶的释放没有显示出缓解作用（P＞0.05），这可能是因为肥大细胞的脱颗粒只能由两个以上相邻的IgE结合表面高亲和力Fc受体（FcεRIs）的交联触发。之前报道过，β-LG-C3G非共价复合物不能降低β-LG的IgE结合能力（通过icELISA测试），但在本研究中，它使肥大细胞脱颗粒减少了46.6%。这意味着β-LG多酚复合物调节肥大细胞脱颗粒功能的其他机制的存在，值得进一步研究。
图7β-LG纯多酚复合物的致敏性评价
β-LG多酚复合物的结构-致敏性关系分析
为了进一步了解β-LG-多酚相互作用的结构-致敏性关系，对β-LG-纯多酚复合物的生理和结构特征及其致敏性进行Pearson相关分析。结果如图8中的热图所示。β-LG多酚复合物的IgG结合抑制率与α-螺旋（r=-0.618，P<0.05）和β-折叠（r=0.655，P<0.05）的比例密切相关。这与先前的假设非常吻合，即复合物中从α-螺旋到β-折叠的转变会导致蛋白质过敏性的降低。先前的研究表明，β-LG的大部分抗原区域位于α-螺旋结构中[53-54]。同样，Pu等人报告称，6种黄酮类化合物对β-LG致敏性的抑制作用伴随着α-螺旋含量的不同降低。
图8 热图显示了β-LG纯多酚复合物的生理或结构特征与其致敏性之间的Pearson相关系数
另一方面，较高的IgG结合抑制率与表面疏水性指数下降（r＝-0.630，P＜0.01）和可溶性蛋白水平升高（r＝0.721，P＜0.01）相关，后两者还与蛋白质二级结构因子的变化有关。然而，关于肥大细胞的脱颗粒，β-己糖胺酶的释放速率与复合物的大多数生理和结构参数之间的相关性相对较弱。过敏患者的IgE引发的肥大细胞活化是复杂关系的结果，这不仅可以用过敏原特异性IgE含量来解释。
Conclusion
在本研究中，为了研究多酚缓解CMA的效力，选择不同的植物材料与牛奶中的主要过敏原β-LG制备非共价配合物。鉴定不同复合物中与β-LG结合的优势多酚，研究其对β-LG结构和致敏性的影响。筛选出越橘果实和黑豆提取物对β-LG的IgE和IgG结合能力具有很强的抑制作用。具有较大分子量和多羟基取代基的黄酮类化合物和单宁更能耐受β-LG构象结构的变化，从而降低β-LG的致敏性。通过相关性分析，证明多酚结合引起的二级结构不稳定和蛋白质解聚与形成的复合物的IgG结合特性密切相关。本研究的结果为理解结构-致敏性关系提供了启示。β-LG多酚复合系统，将有助于开发具有功能性和低致敏性的多酚强化基质。值得一提的是，本研究仅限于使用体外免疫学方法，有必要进一步努力使用动物模型进行体内实验。此外，提取物中可能存在其他具有免疫调节潜力的成分来减轻CMA，多酚之间也可能存在协同或拮抗作用，导致复合物β-LG的残余致敏性发生各种变化。为了进一步证实这些结果，应该进行分子对接等机制方法的探索。
Dietary polyphenols reduced the allergenicity of β-lactoglobulin via non-covalent interactions: a study on the structure-allergenicity relationship
Chi Zhanga,1, Qiaozhi Zhanga,1, Huatao Lia,1, Zhouzhou Chenga, Shiyu Fana, Hujun Xiea, Zhongshan Gaob, Yan Zhangc, Linglin Fua,*
a School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China
b Allergy Research Center, Zhejiang University, Hangzhou 310018, China
c Hebei Food Inspection and Research Institute, Hebei Food Safety Key Laboratory, Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation, Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health, Shijiazhuang 050227, China
1 Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
Studies showed that complexation of polyphenols with milk allergens reduced their immunogenic potential. However, the relationship between structures of polyphenols and their hypoallergenic effects on milk allergens in association with physiological and conformational changes of the complexes remain unclear. In this study, polyphenols from eight botanical sources were extracted to prepare non-covalent complexes with β-lactoglobulin (β-LG), a major allergen in milk. The dominant phenolic compounds bound to β-LG with a diminished allergenicity were identified to investigate their respective role on the structural and allergenic properties of β-LG. Extracts from Vaccinium fruits and black soybeans were found to have great inhibitory effects on the IgE-and IgG-binding abilities of β-LG. Among the fourteen structure-related phenolic compounds, flavonoids and tannins with larger MWs and multi-hydroxyl substituents, notably rutin, EGCG, and ellagitannins were more potent to elicit changes on the conformational structures of β-LG to decrease the allergenicity of complexed β-LG. Correlation analysis further demonstrated that a destabilized secondary structure and protein depolymerization caused by polyphenol-binding were closely related to the allergenicity property of formed complexes. This study provides insights into the understanding of structure-allergenicity relationship of β-LG-polyphenol interactions and would benefit the development of polyphenol-fortified matrices with hypoallergenic potential.
Reference:
ZHANG C, ZHANG Q Z, LI H T, et al. Dietary polyphenols reduced the allergenicity of β-lactoglobulin via non-covalent interactions: a study on the structure-allergenicity relationship[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2617-2628. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250210.
翻译：赵雯（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片由AI生成
为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。
长按或微信扫码进行注册
会议招商招展
联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）
为进一步深入探讨食品产业在当前复杂多变环境下的高质量发展路径，并着重关注食品科学、营养安全保障的基础研究与关键技术研发，贯彻落实“大食物观”和“健康中国2030”国家战略，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志在成功召开前十一届“食品科学国际年会”和五届“食品科学与人类健康国际研讨会”及二十余次食品专题研讨会的基础上，将与国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、湖南省农业科学院农产品加工研究所、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、湖南农业大学长沙现代食品创新研究院共同举办的“第十二届食品科学国际年会”即将于2025年8月9-10日在中国 湖南 长沙召开。
长按或微信扫码进行注册
会议招商招展
联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）
