（来源：MIT News）
近期，麻省理工学院开发出一项新技术，使科学家能够以前所未有的速度、一致性和多样性对完整的三维组织中数百万个单细胞内的蛋白质进行标记。借助这项技术，研究团队在一天内成功地标记了大量组织样本。
目前，这项研究成果已经发表在Nature Biotechnology上。他们通过研究证实，在大组织样本中利用抗体在单细胞水平标记蛋白质的能力，能够揭示其他常用标记方法所无法展现的新见解。
分析细胞正在合成的蛋白质，是生物学、神经科学及相关领域研究的关键，因为细胞在特定时刻表达的蛋白质，能够反映出细胞试图执行的功能，以及细胞对所处环境（如疾病或治疗过程中）的反应。
尽管显微镜和标记技术已经取得显著进展，也带来了大量新发现，但研究人员始终缺少一种可靠且实用的方法，在完整的三维组织中追踪数百万个紧密排列的单细胞的蛋白质表达情况。此前，研究人员只能观察到薄片下的组织切片，因而无法全面了解在整体相连系统中的细胞蛋白表达。
“通常情况下，研究细胞内的分子需要将组织解离为单个细胞，或者将组织切成薄片，这是因为分析所需的光和化学物质无法深入组织内部。” 该研究的资深作者、麻省理工学院皮考尔学习与记忆研究所、化学工程系、大脑与认知科学系副教授 Kwanghun Chung 表示，“我们实验室此前开发了 CLARITY 和 SHIELD 等技术，能够通过把组织‘透明化’来研究整个器官，但现在我们还需要一种新方法对整个器官进行化学标记，从而获取有价值的科学见解。”
“如果组织内的细胞没有被均匀处理，就无法进行定量比较。在传统的蛋白质标记方法中，这些分子可能需要数周时间才能扩散到完整的器官中，这导致在器官规模上对组织进行均匀化学处理效率极低，几乎无法实现。”他补充说。
图｜CuRVE 和 eFLASH 蛋白标记（来源：MIT News）
研究人员开发的这种新方法名为“CuRVE”，是一种全新的统一处理大型密集组织的整体策略。在这项研究中，他们详细介绍了如何通过实施名为 “eFLASH” 的 CuRVE 技术克服技术难题，并通过大量实例展示了该技术，包括其如何为神经科学研究带来新的见解。
“这是一个重大突破，尤其是在技术的实际应用性能方面。” 该论文共同第一作者 Dae Hee Yun 博士（2024 年毕业于麻省理工学院，现任 LifeCanvas Technologies 公司的高级应用工程师。这家初创公司由 Kwanghun Chung 创立，旨在推广其实验室发明的新工具）表示。另一位共同第一作者是 Young-Gyun Park，之前是麻省理工学院的博士后研究员，现在是韩国科学技术院的一名助理教授。论文其他作者还包括 Jae Hun Cho、Lee Kamentsky、Luzdary Ruelas 和 Guoping Feng 等。
巧妙的化学反应
体积较大的三维组织样本难以实现均匀标记的根本原因在于，抗体渗入组织的速度极为缓慢，而与靶蛋白结合的速度却很快。这种速度差异导致的问题是，简单地将大脑浸泡在抗体溶液中，会使组织外缘的蛋白质被大量标记，而深处的细胞和蛋白质几乎无法接触到抗体。
为改进标记效果，研究团队构思出一种方法，这也是 CuRVE 技术的核心概念，旨在解决速度不匹配的问题。具体来说，他们持续控制抗体的结合速度，同时加快抗体在整个组织中的渗透速度。为了明确该方法的可行性并进行优化，他们构建并运行了一个复杂的计算模拟模型，通过这个模型测试不同的设置和参数，包括不同的结合速率、组织密度和组成成分。
随后，他们开始在实际组织中应用这种方法。他们的研究基于此前一项名为 “SWITCH” 的技术，在这项技术中，Kwanghun Chung 的实验室设计出一种暂时阻断抗体结合的方法，让抗体先渗透到组织中，然后再恢复结合。尽管这种方法效果良好，但 Dae Hee Yun 指出，“如果能够持续精准控制抗体结合速度，那么就可以进一步改进。”
然而，SWITCH 技术中使用的化学物质过于强烈，不适合用于持续处理。于是，研究团队在一个类似化学物质库中进行筛选，以期找到一种能够更温和、更持续地限制抗体结合速度的化学物质。最终，他们发现脱氧胆酸是理想的选择。使用这种化学物质，研究团队不仅可以通过改变其浓度来调节抗体结合，还可以通过改变标记浴的 pH 值（或酸度）来进行调控。
与此同时，为加快抗体在组织中的移动速度，研究团队运用了 Kwanghun Chung 实验室此前发明的另一项技术：随机电传输，该技术通过施加电场加速抗体在组织中的扩散。
通过实施这种结合速度可连续调整的加速分散 eFLASH 系统，研究团队报告称，他们总共使用了 60 多种不同的抗体对大组织样本中细胞内的蛋白质进行标记。
值得一提的是，每个样本都在一天内完成了标记，对于完整的器官样本而言，这一速度堪称“超快”。此外，不同的样本准备工作无需重新进行优化步骤。
有价值的可视化呈现
研究团队对 eFLASH 技术进行测试的方式之一，是将其标记结果与另一种常用方法进行对比：对细胞进行基因工程改造，使细胞在目标蛋白质的基因转录时发出荧光。尽管基因方法无需让抗体在整个组织中扩散，但该方法容易出现偏差，因为报告基因的转录和实际蛋白质的生成并非完全同步。
“虽然抗体标记能够可靠且即时地显示靶蛋白的存在，但基因方法在即时性和准确性方面表现较差，即便实际蛋白质已不存在，细胞仍可能发出荧光。”Dae Hee Yun 补充道。
在这项研究中，研究团队在样本中同时采用了这两种标记方法。通过这种可视化对比，他们发现许多抗体标记和基因标记存在显著差异的情况。
例如，在小鼠大脑的某些区域，他们发现根据抗体标记结果，三分之二表达 PV（一种在某些抑制性神经元中大量存在的蛋白质）的神经元，并未表现出基于基因标记的荧光。
在另一个例子中，通过一种名为 ChAT 的蛋白质的基因标记方法检测到表达的细胞中，只有一小部分也能通过抗体标记检测到表达。也就是说，与抗体标记相比，在某些情况下，基因标记可能会严重低估或高估蛋白质的表达水平。
研究人员并非质疑基因报告方法的价值，而是指出在 eFLASH 技术可行的情况下，全器官抗体标记有助于将这些数据置于更丰富、更完整的研究背景中。该论文指出，“我们在健康成年小鼠中发现，PV 免疫反应神经元存在大量区域性缺失，且个体差异明显，这凸显了全面、无偏差表型研究的重要性。”
正如 Dae Hee Yun 所说的那样，两种不同类型的标记方法就像是 “两种不同的研究工具” 。
这项研究的资金来自 Burroughs Wellcome Fund、Searle Scholars Program、McKnight 基金会、Freedom Together 基金会、皮考尔学习与记忆研究所、NCSOFT 文化基金会和美国国立卫生研究院等。
https://news.mit.edu/2025/mit-method-enables-protein-labeling-tens-millions-densely-packed-cells-0206
