药学1区思路分享~黄芪桂枝五物汤通过AMPK/TrkA/TRPM7通路缓解糖尿病心血管自主神经病变

【写在前面】：本期推荐的是由上海中医药大学研究团队近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示黄芪桂枝五物汤通过AMPK/ TrkA/TRPM7通路缓解糖尿病心血管自主神经病变。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Huangqi Guizhi Wuwu Decoction alleviates diabetic cardiovascular autonomic neuropathy via AMPK/TrkA/TRPM7 pathway

民族药理学相关性：糖尿病心脏自主神经病变（DCAN）是糖尿病的严重并发症之一，显著增加了心血管疾病死亡的风险。黄芪桂枝五物汤（HGWD）已被证明对DCAN有效，但其潜在机制尚不明确。

研究目的：观察HGWD对DCAN的临床疗效，并通过动物模型阐明其潜在机制。

材料与方法：本研究共招募了202名符合纳入标准的患者进行临床试验，并随机分为两组。使用美托洛尔作为阳性对照药。观察HGWD对DCAN患者心率变异性的影响。为了进一步阐明其潜在机制，通过超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）测定了HGWD中7种主要成分的含量。利用网络药理学结合分子对接和蛋白质-蛋白质对接预测HGWD治疗DCAN的潜在机制。采用高脂饮食（HFD）和链脲佐菌素（STZ）注射诱导糖尿病大鼠模型。造模成功后，用含有TRPM7重组质粒的腺相关病毒载体（pAAV-TRPM7）对大鼠进行4周的预处理。

结果：临床研究表明，HGWD能减少室性早搏次数，改善心率变异性，纠正DCAN患者心脏自主神经的不平衡。体内实验表明，HGWD降低了糖尿病大鼠对心律失常的易感性，改善了糖尿病诱导的心肌纤维化，抑制了心脏自主神经重塑，并促进了糖尿病大鼠心脏交感神经的修复。从机制上讲，HGWD通过上调AMPK / TrkA通路，从而抑制TRPM7通道，对DCAN产生了改善作用。

结论：HGWD通过调节AMPK / TrkA / TRPM7通路，抑制心脏自主神经系统的重塑，降低室性心律失常的易感性，并改善DCAN，为其临床应用提供了有力支持。

（图文摘要）

【前言】

糖尿病心脏自主神经病变（DCAN）是糖尿病微血管并发症中的一种自主神经病变，其特征是调节心脏和血管的自主神经纤维受损。这会导致交感和副交感神经之间的平衡失调，进而引起心率和血液动力学异常。长期高血糖会引发心脏交感神经和迷走神经的神经重塑，扰乱心脏电生理和复极离散度，并且是糖尿病相关致命性心律失常发生的关键因素。临床流行病学研究显示，约60%的糖尿病患者会并发DCAN，其室性心律失常和心脏性猝死的发生率是非糖尿病患者的约5倍。这凸显了糖尿病对患者长期预后的重大威胁。目前，DCAN的确切病理机制尚不明确，临床管理主要围绕症状控制展开，通常采用β受体阻滞剂、心肌代谢增强剂和神经营养药物，并结合严格的血糖控制。然而，由于心脏自主神经之间的复杂协同和拮抗关系，临床上的单一药物治疗往往难以有效解决心脏自主神经的重塑问题。因此，迫切需要更有效的治疗策略，以最大化临床获益并改善预后。

有趣的是，5'-单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）已被确定为葡萄糖的高敏感受体，它能够将能量感应机制与代谢途径联系起来。多项研究已证实AMPK在调节糖尿病相关并发症（包括心脏问题和糖尿病神经病变）方面发挥着关键作用。胰岛素受体底物（IRS）的Ser789位点作为Trk受体信号适配蛋白，可被AMPK磷酸化，从而调节相关信号事件。神经生长因子（NGF）在心脏再神经支配中起决定性作用，对交感神经再生和过度神经支配至关重要。酪氨酸激酶受体A（TrkA）是NGF的高亲和力受体。被NGF激活的TrkA通过PI3K信号通路调节海马神经元中TRPM7的表达。

TRPM7在中枢神经系统中广泛分布，在心脏中高表达，并在胚胎发育期间的心肌细胞中高度集中。众多研究表明，沉默TRPM7不仅抑制空腹胰岛素降低和胰腺β细胞抗体水平升高，还能预防高血糖引起的血管内皮损伤和神经元死亡。此外，TRPM7通道通过调节Ca2 +和Mg2 +的平衡发挥抗心律失常和抗心肌纤维化作用。抑制TRPM7是DCAN的潜在治疗策略，但糖尿病心脏神经中TRPM7的变化和作用尚不清楚。

然而，由于DCAN病理过程的复杂性，使用单一机制药物难以实现全面和系统的心脏保护。中药方剂作为辅助医学的重要组成部分和心血管药物发现的重要来源，因其多种活性和有效成分的协同作用而越来越受到关注。

黄芪桂枝五物汤（HGWD）是公元3世纪初《金匮要略》中的经典传统中药方剂，用于治疗与DCAN临床表现相同的血瘀症，并在糖尿病神经病变的治疗中显示出明确且精准的疗效。从中医角度看，DCAN的发病机制可以从营卫不和的角度来理解。HGWD被认为具有调和营卫的功能。HGWD由黄芪、桂枝、白芍、生姜和大枣按1:1:1:2:1.1的比例组成。研究表明，HGWD中的活性成分芍药苷可激活AMPK通道，而黄芪皂苷IV可抑制TRPM7通道。然而，HGWD在改善DCAN方面的药理作用和机制尚不明确。鉴于AMPK与糖尿病相关神经病变有关，我们假设激活AMPK可能磷酸化TrkA，从而抑制TRPM7信号传导，延缓糖尿病心脏自主神经重塑。

本研究采用系统方法，通过随机临床试验、超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）分析、生物信息学、基因过表达模型和多种药理实验，全面探讨HGWD对DCAN的治疗效果。我们对HGWD的研究为推进DCAN新药研发奠定了理论基础，阐明了HGWD治疗DCAN的机制，并为未来HGWD研究提供了创新方向。

【结果】

临床研究：研究对象特征（临床数据证明HGWD与美托洛尔疗效相当）

本研究共招募202名患者参与临床试验，按1:1比例随机分为对照组（使用美托洛尔和标准治疗）和HGWD组（使用HGWD和标准治疗）。观察期间，对照组3人、HGWD组2人因失访被排除，HGWD组另有3人拒绝治疗被排除。最终194名患者完成试验，其中HGWD组95人，对照组99人。患者基线特征见表2，两组基线数据无显著差异。

临床研究：HGWD治疗改善DCAN患者的心率变异性

SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50水平反映心脏自主功能。SDNN和SDANN水平与交感神经活动呈负相关，RMSSD和pNN50水平与副交感神经活动呈正相关。治疗后，两组HbA1c水平和室性早搏次数显著下降（P < 0.05，P < 0.01），SDNN、SDANN和pNN50水平不同程度升高。但对照组治疗后RMSSD水平与治疗前相比无统计学差异（表3和表4）。此外，HGWD组治疗后SDNN、RMSSD和pNN50的上调幅度大于对照组（P < 0.05）（表5）。

1、HGWD抑制STZ诱导的心律失常和心肌重塑易感性

采用PES和心电图评估HGWD对心律失常易感性的影响。结果显示，模型组PES后易发生多种心律失常，包括室性早搏和室性心动过速，室性心律失常发生率显著高于对照组（P < 0.05），表明模型组心律失常易感性增加。相比之下，HGWD以剂量依赖性方式降低PES后心律失常和室性心律失常的发生率，提示HGWD可有效降低糖尿病心律失常的发生率（图1A和B）。随后，采用组织病理学方法评估HGWD对糖尿病大鼠的影响。H&E染色结果显示，HGWD可改善心肌纤维化。对照组心肌细胞结构清晰、排列有序、大小正常、形态规则，无炎症细胞浸润；模型组心肌细胞大小不一、排列紊乱、结构模糊，并有少量炎症细胞浸润。

HGWD治疗后，心肌细胞排列更有序，体积减小，形态清晰（图1C）。STZ干预使心肌纤维化标志物表达异常增加。因此，采用Masson染色定量评估心肌纤维化程度。结果显示，模型组心肌组织中胶原纤维面积显著增加，增殖广泛，盘绕成网并不规则地包围心肌纤维组织。而HGWD组心肌纤维排列整齐，无断裂，HGWD显著以剂量依赖性方式减少心肌组织中胶原纤维面积（图1D和E）。

HGWD抑制糖尿病大鼠心脏自主神经重塑并促进心脏交感神经修复

通过免疫组化、RT-qPCR和Western Blot评估心脏自主神经再生标志物（TH、ChAT和GAP-43）水平，确定HGWD对糖尿病自主神经病变的影响。既往研究表明，TH和ChAT阳性表达分别代表心脏交感和副交感神经分布，GAP-43可用于评估心脏自主神经系统生长活性。免疫组化结果显示，模型组心肌组织中TH、ChAT和GAP-43阳性神经纤维分布显著增加，以及上颈交感神经节中GAP-43阳性神经纤维分布增加。HGWD组阳性神经纤维分布面积显著减少，高剂量组减少更明显（图1F-I）。

随后，RT-qPCR结果显示，模型组TH和ChAT mRNA水平显著增加，而HGWD治疗后呈剂量依赖性下降（图1J）。此外，Western Blot显示模型组上颈交感神经节组织中TH和ChAT水平升高，HGWD治疗后减轻（图1K和L）。这些结果表明，HGWD剂量依赖性地抑制自主神经重塑并促进糖尿病大鼠心脏交感神经修复。

2、 HGWD 中主要成分的定量分析

HGWD 的指纹图谱见图 2。采用超高效液相色谱 - 质谱联用（UPLC-MS）初步确定 HGWD 含有木蝴蝶素（C₁₆H₁₂O₅）、黄芪皂苷 IV（C₄₁H₆₈O₁₄）、桂皮醛（C₉H₈O）、芍药苷（C₂₃H₂₈O₁₁）、6- 生姜酚（C₁₇H₂₆O₄）、8- 生姜酚（C₄₃H₃₂O₂₀）、10- 生姜酚（C₂₁H₃₄O₄）等主要成分。含量测定显示，原药中芍药苷含量为 46.7851 μg/mL，桂皮醛含量为 79.0730 μg/mL，木蝴蝶素含量为 131.7817 μg/mL，6- 生姜酚含量为 97.7470 μg/mL，黄芪皂苷 IV 含量为 21.2615 μg/mL，8- 生姜酚含量为 39.7118 μg/mL，10- 生姜酚含量为 33.3605 μg/mL。芍药苷的保留时间为 18.094 分钟，桂皮醛的保留时间为 30.626 分钟，木蝴蝶素的保留时间为 38.272 分钟，6- 生姜酚的保留时间为 58.995 分钟，黄芪皂苷 IV 的保留时间为 79.022 分钟，8- 生姜酚的保留时间为 81.916 分钟，10- 生姜酚的保留时间为 84.383 分钟。其中，在 203 纳米处 6- 生姜酚、黄芪皂苷 IV 和 10- 生姜酚有较好响应；在 210 纳米处 8- 生姜酚有较好响应；在 220 纳米处桂皮醛和木蝴蝶素有较好响应；在 230 纳米处芍药苷有较好响应。

3、网络药理学预测 HGWD 治疗 DCAN 的机制

基于 TCMSP 数据库和 UPLC-MS 分析，确定 HGWD 的 75 种活性成分。获得与 HGWD 成分相关的 1728 个靶点以及 DCAN 的 1906 个潜在靶点。随后，确定其中 276 个靶点为 HGWD 治疗 DCAN 的潜在治疗靶点（图 3A）。通过 Cytoscape 3.6.0 分析发现，有 60 个核心靶点的度值≥10（图 3B）。对这 60 个核心治疗靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。根据 GO 富集分析，HGWD 对 DCAN 的分子功能涉及蛋白激酶结合和蛋白激酶活性。生物过程与细胞对细胞因子刺激的反应和对激素的反应有关。细胞组分与膜筏和转录调节复合体等有关（图 3C 和 D）。此外，KEGG 分析表明，HGWD 治疗 DCAN 可能与 AMPK 信号通路有关（图 3E）。

4、基于生物信息学预测 HGWD 中活性成分与 AMPK 靶点的相互作用

采用分子对接和表面等离子体共振（SPR）技术，确定 HGWD 中的 7 种活性成分与 AMPK 的特异性结合模式和亲和力。在分子对接过程中，调整它们的构象以结合到不同的蛋白质空腔中，每组对接运行重复 3 次。我们计算了平均值和标准差，结果显示大多数关键成分对靶点具有较强的结合特性（表 6），并选择对接结果的最佳结合模式进行三维可视化（图 4）。其中，芍药苷通过与 AMPK 的 PHE-27、ASN-162、LYS-60、LYS-141 和 THR-26 形成氢键结合，结合能为 -7.27±0.35 千卡 / 摩尔，抑制常数（Ki）为 4.65 微摩尔，SPR 结合能 KD 为 35.73 微摩尔。木蝴蝶素通过与 AMPK 的 GLY-28、GLY-27、ASP-157 和 GLY-25 形成氢键结合，结合能为 -7.07±0.12 千卡 / 摩尔，Ki 为 6.55 微摩尔，SPR 结合能 KD 为 0.28 微摩尔。

黄芪皂苷 IV 通过与 AMPK 的 PHE-27 和 GLY-28 形成氢键结合，结合能为 -7.73±0.15 千卡 / 摩尔，Ki 为 2.15 微摩尔，SPR 结合能 KD 为 7.31 微摩尔。桂皮醛通过形成 3 个氢键与 AMPK 结合，结合能为 -5.13±0.12 千卡 / 摩尔，Ki 为 1.72 微摩尔，SPR 结合能 KD 为 0.01 微摩尔。其中，芍药苷、木蝴蝶素和黄芪皂苷 IV 可以结合到 AMPK，并且具有快速结合和解离的特性。因此，很可能黄芪皂苷 IV 或芍药苷和 AMPK 形成了稳定的复合物，这可以促进 PHE-27 与磷酸结合并发生磷酸化，从而激活 AMPK。同时，黄芪皂苷 IV 或木蝴蝶素也可能与 AMPK 形成稳定的复合物，这可以促进 GLY-28 与磷酸结合并发生磷酸化。上述结果预测 AMPK 可能是 HGWD 活性成分对 DCAN 保护作用的潜在靶点。

5、HGWD 通过调节 AMPK/TrkA 通路抑制糖尿病心脏自主神经病变

进一步研究表明，在糖尿病模型中，AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平降低，而 HGWD 能够逆转这种效应（图 5A 和 B）。

基于上述分子对接和 SPR 结果，为了确定 HGWD 是否通过上调 AMPK/TrkA 信号来改善 DCAN，我们使用 AMPK 抑制剂来消除 HGWD 在糖尿病模型中促进 AMPK 磷酸化的作用，并使用 AMPK 激动剂来模拟 HGWD 促进 AMPK 磷酸化的效果。

结果表明，AMPK 激活后，糖尿病心律失常易感性降低，PES 后诱导室性心律失常的可能性降低。相反，抑制 AMPK 表达后，心律失常易感性增加。与 AMPK 抑制剂组相比，HGWD + AMPK 抑制剂组的心律失常易感性降低，这表明HGWD 通过激活 AMPK 抑制糖尿病心律失常易感性（图 5C 和 D）。

免疫组化结果显示，AMPK 激活减少了心肌组织中 TH 和 ChAT 阳性神经纤维的分布面积，而 AMPK 抑制则使相关阳性神经纤维的分布面积比模型组增加。此外，与 AMPK 抑制剂组相比，HGWD + AMPK 抑制剂组中所有阳性神经纤维的分布面积均有所减少（图 5E 和 F）。Western Blot 显示，与模型组相比，HGWD 组和 AMPK 激动剂组中 AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平以及 NGF 表达水平升高，而 TH 和 ChAT 表达水平降低。相反，AMPK 抑制剂干预则产生相反的效果。与 AMPK 抑制剂组相比，HGWD 治疗后 AMPK 和 TrkA 的磷酸化水平以及 NGF 表达水平显著升高，而 TH 和 ChAT 表达水平显著降低（图 5G 和 H）。这证实了 HGWD 通过激活 AMPK/TrkA 通路对 DCAN 发挥治疗作用的假设是可行的（进一步论证）。

6、TRPM7 是糖尿病心血管自主神经病变的关键介质

研究表明，TrkA 受体与 TRPM7 在海马神经元上共定位，TrkA 信号通路参与调节缺血再灌注和氧糖剥夺期间海马神经元中 TRPM7 的表达。然而，TrkA 与 TRPM7 在 DCAN 中的关系尚未得到证实。首先，我们对 TrkA 和 TRPM7 进行了刚性蛋白质 - 蛋白质对接，以预测它们之间的关系。如图 6A 和表 7 所示，TrkA 和 TRPM7 通过酪氨酸 104 - 谷氨酸 164 和组氨酸 108 - 谷氨酸 164 等氨基酸残基位点形成氢键，表明两者之间形成了稳定的蛋白质对接模型。

为了验证两者之间的关系，我们使用了 TrkA 激动剂（盐酸阿米替林）和 TrkA 抑制剂（larotractinib）来观察它们对 TRPM7 的影响。Western blot 和免疫荧光结果显示，模型组上颈交感神经节中 TRPM7 水平显著升高，HGWD 处理后 TRPM7 表达水平降低。而在 TrkA 抑制剂组中 TRPM7 水平升高，在 TrkA 激动剂组中 TRPM7 水平降低。与 TrkA 抑制剂组相比，HGWD 处理显著降低了 TRPM7 的表达水平（图 6B–E）。这些发现表明，HGWD 可以通过上调 TrkA 磷酸化水平来抑制 TRPM7 的表达，从而改善 DCAN（两两验证）。

7、 HGWD 通过调节 AMPK/TrkA/TRPM7 信号通路降低心律失常易感性和抑制心肌纤维化

如图 6BE 所示，与模型组相比，HGWD 干预后 TRPM7 水平显著降低。为了进一步证实 HGWD 在 DCAN 中对 TRPM7 的潜在调节作用，我们将 AAV-TRPM7 过表达病毒注入糖尿病大鼠的尾静脉。15 天后，通过 RT-qPCR 和 Western blot 验证了 TRPM7 的过表达效率（图 7AB）。随后，我们对 HGWD 处理组进行了观察，以了解其对表型和蛋白水平的影响。结果显示，模型组心律失常易感性增加，PES 后更易诱发室性早搏和室性心动过速。相比之下，TRPM7 抑制剂组心律失常的诱发率显著降低，而 TRPM7-OE 组室性心律失常的诱发率显著升高，这表明抑制 TRPM7 表达可以降低心律失常的易感性。此外，与 TRPM7-OE 组相比，HGWD + TRPM7-OE 组室性心律失常的发生率显著降低，这表明 HGWD 逆转了 TRPM7 激活引起的心脏易感性增加（图 7CD）。

在组织病理学水平上，HE 染色结果显示，TRPM7 抑制剂组细胞排列更有序，形态更清晰，而 TRPM7-OE 组心肌细胞排列紊乱，伴有大量炎症细胞浸润和少量出血点。相反，HGWD + TRPM7-OE 组细胞排列有序，形态规则，体积较小，组织中炎症细胞浸润较少，无出血点（图 7E）。Masson 染色结果显示，与模型组相比，TRPM7 抑制剂组心肌组织中胶原纤维面积显著减少，而 TRPM7-OE 组则显著增加。经 HGWD 处理后，心肌组织的胶原纤维面积较 TRPM7-OE 组减少（图 7F 和 G）。上述病理结果表明，TRPM7 过表达加剧了糖尿病心肌纤维化，而 HGWD 通过沉默 TRPM7 改善了心肌纤维化。

8、 HGWD 通过抑制 TRPM7 减轻糖尿病心脏自主神经重塑并促进心脏交感神经修复

在糖尿病大鼠中激活 TRPM7 表达后，我们进一步使用免疫组化和免疫荧光检测心肌和交感神经节组织中 TH、ChAT 和 GAP-43 的分布。这旨在探讨 HGWD 在改善糖尿病自主神经重塑效果中的潜在机制。结果显示，糖尿病心肌组织中 TH、GAP-43 和 ChAT 阳性神经纤维的分布增加。与模型组相比，TRPM7 抑制剂组中棕色染色的 TH、GAP-43 和 ChAT 阳性神经纤维的分布面积显著减少，而 TRPM7-OE 组则显著增加。同时，与 TRPM7-OE 组相比，HGWD 处理减少了 TH、GAP-43 和 ChAT 阳性神经纤维的分布面积，表明 HGWD 通过抑制 TRPM7 表达降低了心肌组织中 TH、ChAT 和 GAP-43 的表达水平（图 8A 和 C）。

此外，免疫组化显示，交感神经节中 GAP-43 和 TRPM7 的分布趋势与心肌组织中一致。与模型组相比，抑制 TRPM7 减少了交感神经中 GAP-43 阳性神经纤维的分布，而激活 TRPM7 则增加了阳性神经纤维的分布。经 HGWD 处理后，阳性神经纤维的分布面积显著减少，表明 HGWD 通过沉默 TRPM7 促进交感神经修复（图 8B 和 D）。

9、在免疫荧光实验中，TH 和 ChAT 呈绿色，TRPM7 呈红色。这些结果表明，DCAN 与 TRPM7 的上调有关。

与模型组相比，经 HGWD 和 TRPM7 抑制剂处理后，TH-TRPM7 和 ChAT-TRPM7 双标荧光强度降低，而 TRPM7-OE 组则显著增强，表明 TRPM7 激活倾向于诱导糖尿病心脏自主神经增生。此外，与 TRPM7-OE 组相比，HGWD + TRPM7-OE 组中 TH-TRPM7 和 ChAT-TRPM7 双标的荧光强度降低（图 9）。

10、为了探讨 HGWD 是否影响 TH 和 ChAT 的 mRNA 水平，我们通过 RT-qPCR 检测了各组的 mRNA 水平变化。

结果显示，模型组心肌组织中 TH 和 ChAT 的 mRNA 水平升高，HGWD 降低了两者的 mRNA 水平，且高剂量时下调效果更明显。此外，与模型组相比，TRPM7 抑制剂组的 TH 和 ChAT mRNA 水平显著降低，而 TRPM7-OE 组则显著升高。此外，HGWD + TRPM7-OE 组的 TH 和 ChAT mRNA 水平显著低于 TRPM7-OE 组（图 10A）。

此外，NGF 是一种调节神经元发育并维持其活性的蛋白质，长期以来被认为是交感神经元生存必需的神经营养因子。目前的研究表明，NGF 的表达水平可能与局部交感神经支配密度密切相关。

我们进一步使用 Western Blot 分别检测了心肌组织和交感神经节中 TH、ChAT、GAP-43 和 NGF 的分布。HGWD 以剂量依赖性方式降低了 TH、GAP-43 和 ChAT 的表达水平，同时增加了 NGF 的表达水平。TRPM7 抑制剂组的 TH、GAP-43 和 ChAT 表达水平较低，NGF 表达水平较高，而 TRPM7-OE 组则相反。经 HGWD 处理后，HGWD + TRPM7-OE 组的 TH、GAP-43 和 ChAT 表达水平显著降低，而 NGF 表达水平升高（图 10B–E）。这些发现表明，HGWD 通过抑制 TRPM7 对糖尿病自主神经重塑产生抑制作用，并促进心脏交感神经修复。

近期研究表明，糖尿病心脏自主神经重塑降低了室性心律失常的阈值，可能是恶性心律失常事件发生率升高的重要机制。然而，由于心脏交感和副交感神经之间的复杂关系——它们既协同又拮抗还相互转化——目前针对单一神经的治疗干预无法有效解决心脏自主神经重塑的问题。中医的“营卫学说”涵盖了机体内部阴阳的整体和动态平衡，强调通过机体自身的调节和修复机制恢复稳态。因此，本研究创新性地运用这一理论来理解DCAN的病理生理进展。基于这一理论框架制定的HGWD在临床实践中广泛用于治疗糖尿病神经病变，并显示出独特的疗效。

我们首先通过随机临床试验评估了HGWD治疗DCAN的临床疗效。鉴于心率变异性（HRV）的无创性和客观性，欧美专家组在20世纪90年代提出将HRV作为评估自主神经活动的最佳定量指标。HRV捕捉RR间期之间窦性节律的细微变化，是反映心脏自主神经系统平衡的敏感指标。在糖尿病神经病变的早期阶段就会出现HRV的变化，这使得能够监测早期糖尿病患者的自主神经功能变化，以便早期发现。在本研究中，我们采用HRV时域分析来研究DCAN患者。HRV参数包括SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50。

SDNN表示患者平均正常RR间期的标准差，而SDANN表示每5分钟平均正常RR间期的标准差。这两个参数均用于评估交感神经系统的活动，其水平降低通常与交感神经紧张增加相关。RMSSD反映相邻RR间期差值的均方根，而pNN50表示总相邻RR间期差值>50ms的百分比，两者均与副交感神经活动成正比。对入组患者进行HRV分析发现，SDNN、SDANN、RMSSD和pNN50指标均低于正常值，这表明长期高血糖损害了心脏自主神经系统的功能，表现为交感神经活动增加和副交感神经活动受损。经过HGWD治疗后，与Betaloc组相比，HRV参数水平在不同程度上有所提高，这表明HGWD抑制了交感神经活动，改善了副交感神经活动，并可能在保护心脏迷走神经的同时恢复自主神经系统的平衡。

血糖控制不佳是DCAN的一个独立危险因素。在血糖调节初次失衡时就发现了心脏自主调节受损。长期高血糖导致炎症介质释放增加、氧化应激和晚期糖基化终产物形成，从而引发电解质和代谢紊乱，这是心脏自主神经调节异常的基础。DCCT（糖尿病控制与并发症试验）研究表明，强化血糖控制使DCAN的患病率降低了50%。经过HGWD治疗后，DCAN患者的HbA1c水平显著下降。HGWD通过其降糖作用同时缓解了DCAN。在这方面，建议加强对T2DM患者血糖水平和HbA1c水平的临床监测，这有助于减少DCAN的发生。

此外，糖尿病患者的心脏交感神经会发生过度增生，即所谓的神经重塑。长期高血糖可导致心脏自主神经（包括交感神经和胆碱能神经）的重新分布。交感和副交感神经在空间分布和功能上的不平衡导致心肌细胞对儿茶酚胺和乙酰胆碱的敏感性发生改变，从而引起心肌细胞的电生理紊乱。TH、ChAT和GAP-43是心脏自主神经重新分布的相关标志物。其中，TH反映心脏中交感神经的分布，ChAT是对迷走神经分布和重新分布的标志物，而GAP-43是用于标记新生心脏中自主神经的重要物质之一。

我们的研究发现，在糖尿病状态下，TH、ChAT和GAP-43的水平显著升高。HGWD干预减缓了这一进程，减少了PES后诱发室性早搏和室性心动过速等心律失常的可能性。这表明HGWD可以降低糖尿病心律失常的易感性，抑制糖尿病自主神经重塑，并促进心脏交感神经的修复。

为了更好地理解HGWD治疗DCAN的药理机制，我们进行了UPLC-MS、网络药理学、分子对接和SPR实验。结果表明，HGWD的活性成分可能通过激活AMPK通路对DCAN发挥治疗作用。AMPK作为一种对葡萄糖高度敏感的受体，是糖尿病和其他代谢性疾病研究的焦点。STZ诱导的糖尿病会导致严重高血糖，随后损害神经生物能量学并降低AMPK活性。作为一种AMPK激活剂，二甲双胍已被证明可以缓解糖尿病神经病变相关的痛觉过敏和触觉过敏。

在我们的研究中，HGWD治疗在糖尿病大鼠中对AMPK通路产生了与二甲双胍类似的影响。HGWD治疗显著激活了AMPK通路。此外，HGWD对AMPK通路的激活影响了糖尿病大鼠中TrkA的表达。我们观察到在高糖条件下TrkA活性受到抑制，而AMPK信号的抑制导致TrkA磷酸化水平显著下降，同时神经标志物的表达水平显著上升。然而，HGWD干预上调了AMPK/TrkA的表达水平。

研究表明，在神经元中，AMPK在Ser789处磷酸化TrkA信号适配蛋白IRS。TrkA作为NGF的特异性高亲和力受体，介导NGF的大多数生物功能。值得注意的是，TrkA促进神经再生和修复，其与上游NGF的结合抑制了炎症因子的释放，从而减少炎症引起的神经损伤。NGF在心脏再神经支配中起着关键作用，作为参与交感神经再生和过度神经支配的化学趋向因子。我们的研究发现，HGWD增加了NGF的表达水平，并在糖尿病模型中促进了心脏交感神经的再生。此外，Ieda等指出，糖尿病会导致心肌细胞中NGF表达下降，从而引发DCAN。

此外，被NGF激活的TrkA通过PI3K信号通路在海马神经元中抑制TRPM7的表达。研究表明，电针可以通过TrkA/PI3K途径调节大鼠脑缺血/再灌注后TRPM7的表达。刚性蛋白质-蛋白质对接结果表明，TrkA和TRPM7形成了稳定的蛋白质对接模型。我们发现，TrkA激活后TRPM7水平下降，这表明TrkA直接影响TRPM7的表达，无需通过其他途径介导。利用pAAV-TRPM7干扰糖尿病大鼠中TRPM7的表达，我们的研究表明，TRPM7的激活增加了心律失常的易感性，加剧了心肌纤维化，并提高了心脏自主神经重新分布标志物的表达水平。这表明TRPM7可能是抑制自主神经重塑的潜在靶点。

研究表明，TRPM7在糖尿病的病理生理过程中发挥作用，在高糖条件下在免疫细胞和血管内皮细胞中大量表达。TRPM7是胰腺内分泌发育和高脂饮食诱导的β细胞增殖的关键调节因子。抑制TRPM7表达已被证明可以提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌，以缓解Ⅰ型糖尿病。同时，通过基因沉默抑制成年大鼠大脑中的TRPM7通道，结果导致神经元死亡显著减少，从而表明TRPM7通道可能对神经元具有保护作用。综上所述，HGWD通过激活AMPK、进一步磷酸化TrkA以及促进TrkA与NGF的结合，在预防和控制DCAN方面发挥了重要作用，从而抑制了TRPM7通道的表达。

最后，由于临床研究样本量较小、观察期较短，有必要进一步增加样本量和观察指标，以获得更客观的研究结果。

【结论】

综上所述，HGWD通过调节AMPK/TrkA/TRPM7通路，抑制了心脏自主神经系统的重塑，降低了室性心律失常的易感性，并改善了DCAN。进一步阐明了TRPM7与DCAN之间的新关联，提示TRPM7可能是解决自主神经重塑问题的潜在靶点。此外，本研究为在慢性病干预中应用传统中药方剂HGWD奠定了基础，突显了其高度的临床适用性。

关键实验步骤与逻辑链

1、临床疗效验证

对象：194例DCAN患者（HGWD组 vs 美托洛尔组）

指标：HRV参数（SDNN、RMSSD等）、HbA1c、室性早搏次数

结论：HGWD显著改善自主神经失衡，效果与美托洛尔相当。

2、活性成分鉴定

方法：UPLC-MS定量分析HGWD中7种成分（如芍药苷46.7851 μg/mL）

3、网络药理学预测

数据库挖掘：HGWD成分→276个潜在靶点，KEGG富集显示AMPK通路相关。

分子对接：芍药苷、黄芪皂苷IV等与AMPK结合能≤-5 kcal/mol，提示强结合。

4、AMPK/TrkA通路验证

动物干预：糖尿病大鼠分组（HGWD组、AMPK激动剂组、AMPK抑制剂组）