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Abstract
本研究报告了从南瓜中分离纯化得到的3种多糖组分（SPS-F1、SPS-F2和SPS-F3）的结构特征。SPS-F1（分子量（Mw）＝12.30 kDa）和SPS-F2（Mw＝19.40 kDa）分别可能含有果胶多糖的同型半乳糖醛酸聚糖（HG）和鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）结构域。SPS-F3（Mw＝270.4 kDa）主要由鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。用SPS处理可降低2型糖尿病大鼠的体质量增加、血糖和甘油三酯水平。此外，基于尿液代谢组学分析确定了25种差异代谢物，它们对SPS的抗糖尿病作用至关重要。烟酰胺-N-氧化物、组胺、顺乌头酸、柠檬酸、L-苹果酸、3-(3-羟基苯基)丙酸和N-乙酰-L-天冬氨酸的调节主要与能量代谢、肠道微生物群和炎症有关。表面等离子体共振研究揭示了与半乳凝素-3（Gal-3）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）的结合动力学。SPS-F2和SPS-F3与Gal-3的Kd值分别为4.97×10⁻³和1.48×10⁻³ mol/L，表明结合亲和力较弱。所有3个组分与FGF2都有中等结合，亲和力为SPS-F3 ＞ SPS-F2＞SPS-F1。因此，代谢组学和表面等离子体共振方法被证明是探索SPS抗糖尿病作用的有前途的工具，并为深入了解其机制提供了依据。
Introduction
南瓜（Cucurbita Moschata，Duch）在世界各地广泛种植，南瓜果实中含有多种营养和功能性成分，受到了广泛关注。南瓜多糖（SPS）已被报道对包括高血糖、高血脂和肥胖在内的多种代谢紊乱有缓解作用。作为一种来自天然来源的植物多糖，其安全性已得到广泛认可。近年来，特定人群食用南瓜多糖作为保健品备受关注。多糖的生物活性特性主要由其结构特征决定，包括分子量（Mw）、单糖组成和官能团。在我们之前的研究中，粗制南瓜多糖的含量约为92%，分子量分布在12～280 kDa之间。粗制南瓜多糖主要由半乳糖醛酸（GalA）、鼠李糖（Rha）和半乳糖（Gal）组成，据估计在南瓜多糖的不同组分中存在同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）或阿拉伯半乳聚糖（AG）结构域。然而，南瓜多糖中主要组分的结构特征仍不清楚，其构效关系和功能机制也仍需进一步研究。
2型糖尿病是一种与碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢有关的慢性疾病。慢性高血糖可导致胰岛素作用紊乱和下游代谢功能障碍。关键代谢物的变化对糖尿病患者的风险预测、临床诊断和治疗效果具有重要意义。因此，高通量检测和分析策略的应用至关重要。代谢组学是一种强大的工具，当生命系统中发生特定的刺激或影响时，它可以提供代谢谱的变化。代谢组学方法和分析方法发展迅速，在许多领域显示出潜力，包括参与T2DM发病和治疗的生物标志物。
与生物功能相关的生物分子相互作用也为它们所参与的生物过程机制提供了线索。带电多糖显示出与蛋白质的潜在相互作用，它们与功能蛋白的相互作用代表了治疗干预的潜在靶点。在我们通过表面等离子体共振（SPR）进行的初步实验中，粗SPS显示出与半乳糖凝集素-3（Gal-3）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）结合的潜力，在代谢紊乱中具有重要作用。然而，对SPS组分与功能蛋白之间的结合行为知之甚少。
本研究制备了SPS的三个主要组分，并对其进行了结构表征，包括分子量分布、单糖组成和核磁共振（NMR）谱。采用非靶向方法研究SPS治疗后T2DM大鼠的代谢组学特征。利用SPR在分子水平上分析了SPS组分与Gal-3和FGF2的相互作用和结合特性。这些结果为研究SPS影响T2DM的潜在机制提供了新的视角，并为促进这些天然多糖的进一步开发利用提供了新的见解。
Results and Discussion
SPS馏分组成及结构分析
在0.2 mol/L NaCl洗脱液中出现单峰（图1A），采集为SPS-F1。在0.3 mol/L NaCl洗脱液中有两个主要峰，分别是SPS-F2和SPS-F3（图1B）。SPS-F2和SPS-F3通过收集不同保留时间的峰进一步分离。纯化后，SPS中F1、F2和F3的分子量分别为12.3、19.4和270.4 kDa（图1C-E），质量比为0.66:1.0:0.2。具体而言，三个部分在不同领域的大小分布不同，计算得到的多分散指数分别为1.181、1.36和1.06。
图1 不同SPS组分的HPGPC色谱图及分子量分布
SPS对T2DM大鼠的抗糖尿病作用
各组T2DM大鼠均连续饲喂HFD。与HFD组相比，SPS治疗后体质量增加、血糖和甘油三酯（TG）水平显著降低（P＜0.05）；此外，高密度脂蛋白（HDL）水平显著升高。前人研究表明，SPS对T2DM大鼠具有脂质调节作用。但在总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）水平上，SPS组与HFD组无显著差异。2型糖尿病是一种以高血糖和血脂异常为特征的慢性代谢疾病。T2DM患者血清TC、TG和LDL水平高可导致大血管并发症。综合以上结果及前人研究，葡萄糖耐量、胰岛素耐量及氧化应激状态值得后续研究关注。在本研究中，SPS显示了降脂作用在2型糖尿病大鼠中，表明南瓜多糖可能是2型糖尿病患者饮食中的一种良好补充。
图2 SPS和MET处理对T2DM大鼠血清生化指标的影响
UHPLC-Q-TOF/MS尿液代谢谱分析
如图3A所示，SPS组和HFD组的代谢物谱明显分离。为确定模型的适用性和预测能力，对OPLS-DA模型在正离子模式（R2Y＝0.999，Q2＝0.562）和负离子模式（R2＝0.766，Q2＝0.737）下的参数进行了7倍交叉验证，验证了模型的可靠性和稳定性。根据置换检验的结果（图3B），本实验模型没有过拟合。OPLS-DA模型中明显的分离趋势表明，SPS组和HFD组在基线时代谢物存在差异。进一步分析尿液中代谢物的差异，结合动物实验的结果，可以证明SPS治疗的抗糖尿病机制。
图3 SPS与HFD分别在阳性和阴性模式下的OPLS-DA分析和排列检验
鉴别差异代谢物
为了可视化差异代谢物的结果，分层聚类分析作为一种有效的数据挖掘和统计方法被应用。SPS组和HFD组代谢物的具体表达模式通过创建热图进一步表征，该热图提供了顶部差异代谢物的概述。如图4所示，具有相似强度趋势的代谢物相互聚集在一起，并用不同的颜色标记变化的程度。此外，SPS组与HFD组基本呈簇状分离，这清楚地揭示了差异代谢物相对含量变化的生物学潜力。
图4 分别在SPS与HFD的（A）阳性和（B）阴性模式下差异表达代谢物谱的分层聚类表示
KEGG通路富集分析
应用KEGG数据库进行途径富集分析（图5），揭示相关途径和可能机制。利用Fisher精确法计算富集通路的意义。路径富集分析基于路径富集因子和路径拓扑分析的P值识别所有匹配路径。根据路径富集因子和路径拓扑分析的P值，确定了所有匹配的路径。一般来说，P值越小，富集显著性越高。在尿样中，SPS处理后主要影响三羧酸（TCA）循环、乙醛酸和二羧酸代谢、胰高血糖素信号通路丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。
图5 SPS与HFD的富集KEGG通路分析
生化判读
在本研究中，SPS显著降低了体质量增加以及血清中葡萄糖和脂质水平。由于代谢紊乱与T2DM有关，我们通过对尿液代谢物进行鉴定，探讨与SPS作用相关的差异代谢物。TCA循环在线粒体中起关键作用，调节电子传递链并通过ATP的产生能量。由于TCA与各种合成代谢和分解代谢密切相关，糖酵解和脂肪酸降解的最终产物都参与了TCA循环。在以往的研究中，TCA循环与糖尿病的进展有关。TCA循环中关键的中间代谢物，包括柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸和顺式乌头酸，在饮食性高脂血症和糖尿病患者的尿样中显著减少。在本研究中，经SPS处理后，尿中的柠檬酸盐、l-苹果酸和顺式乌头酸上调。柠檬酸盐通过满足糖酵解途径对NAD+的需求来调节肝脏的糖酵解和糖异生。因此，多种TCA循环中间体水平的增加表明，SPS处理可以通过增强T2DM大鼠的TCA循环来调节线粒体的能量代谢。
尿液中有机酸的代谢物提供了丰富的各种代谢信息，包括肠道菌群代谢，这也是功能化合物活性的靶标。近年来，许多研究表明，肠道菌群及其代谢物可随着T2DM的发展而发生变化。羟苯丙酸（HMPP）是Clostridia和Bacaeroides等厌氧菌产生的代谢物之一，T2DM患者肠道菌群中Clostridia呈下降趋势。与HFD组相比，SPS组3-羟基苯基丙酸升高，这与既往研究一致。随着厌氧菌群的增加，肠道菌群也发生了变化。
烟酰N-氧化物是烟酰胺的代谢物，具有抗炎活性。烟酰胺是烟酸的一种主要形式，它有助于碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢。烟酰胺紊乱与多种代谢性疾病有关。此外，烟酰胺升高可导致血清LDL水平降低。SPS治疗后T2DM大鼠尿液中烟碱N-氧化物水平升高，这与SPS治疗后血清中LDL的降低一致。组胺是另一种参与炎症反应的代谢物。组胺不耐受与2型糖尿病直接相关，糖尿病患者组胺水平升高。糖尿病患者晚期糖基化终产物的积累导致肥大细胞脱粒和组胺释放。在本研究中，与HFD组相比，SPS组尿液中的组胺含量降低（倍数变化＝0.47）。因此，调节靶器官炎症因子，改善炎症状态对T2DM有积极作用。
SPS馏分与Gal-3的相互作用
多糖分子的结构特征对结合相互作用至关重要。因此，SPR光谱被用于监测SPS馏分与Gal-3的结合行为。在相同浓度（2 mg/mL）下，测定了SPS-F1、SPS-F2和SPS-F3与Gal-3固定化传感器芯片的结合情况，其相互作用的SPR传感器图和最大结合信号如图6A和B所示。SPS-F2和SPS-F3均观察到平滑的结合曲线，且SPS-F3的信号强于SPS-F2。为了进一步研究其结合动力学，我们测量了不同浓度的SPS-F2和SPS-F3与Gal-3的结合动力学，并提供Chi2值来衡量实验数据与拟合曲线的平均偏差。SPR结合感测图如图6C和D所示。
图6 Gal-3与SPS组分结合的SPR分析
Gal-3分子质量为29～35 kDa，广泛存在于多种细胞中。它具有一个可以结合β-半乳糖苷聚糖的碳水化合物识别结构域（CRD）。此外，Gal-3结合到半乳的非还原端，并且结合亲和力随着半乳链的长度而增加。最近有研究表明，Gal-3在糖尿病患者中高表达，缺乏Gal-3可以预防糖尿病的发生。已经研究了Gal-3与几种植物源性多糖之间的相互作用，以扩大多糖的健康用途。人参果胶和不同结构的改性柑橘果胶对半乳糖凝集素-3的作用有不同的影响，其中RG-I中β-1,4半乳糖侧链起重要作用。此外，构效关系分析表明，半乳糖水平较高、半乳糖侧链较长的RG-I结合能力较强。主链上的甲基化和乙酰化也能增强结合。在本研究中，SPS-F2和SPS-F3都能与Gal-3结合。已发表的研究表明，RG-I结构域比RG-II和HG结构域对凝集素具有更强的结合活性，而低聚半乳糖醛酸酯对凝集素没有结合活性。在这项研究中也发现了类似的结果。SPS侧链上的半乳糖是结合和抑制Gal-3的关键因子。这些结果与先前的构效关系研究一致，表明SPS可能在代谢紊乱中作为Gal-3抑制剂。
SPS组分与FGF2的相互作用
测定了SPS组分与FGF2的相互作用，相互作用的传感图和最大结合信号如图7所示。所有组分（SPS-F1、SPS-F2和SPS-F3）均与FGF2具有结合亲和力。
图7 FGF2与SPS组分结合的SPR分析
FGF2是成纤维细胞生长因子家族（FGFs）的一员，广泛存在于人体中，具有多种功能，包括创伤修复、炎症反应和促进血管生成。作为一种分泌蛋白，FGF2通过与特异性FGF受体（FGFR）相互作用介导，而这些相互作用可通过肝素调节。最近，人们对开发糖仿生学作为FGF信号通路的调节剂的兴趣有所增加。FGF2是糖尿病发生过程中心脏肥厚和纤维化的重要调节因子，在调节胰岛素表达方面具有潜在作用。SPS组分与FGF2的相互作用提示其对代谢性疾病的血管病变有有益作用。在本研究中，具有RG-I结构域的SPS组分与FGF2的结合亲和力高于HG结构域。结合亲和力也可能随着分子量的增加而增加，但还需要进一步的研究来揭示其构效关系和潜在的机制。
Conclusion
从南瓜中分离得到多糖3个组分（SPS-F1、SPS-F2和SPS-F3），分子量分别为12.3、19.4和270.4 kDa。SPS治疗可降低T2DM大鼠的体质量增加、血糖和TG水平。通过尿代谢组学分析和多变量统计分析来评价SPS对2型糖尿病大鼠的抗糖尿病作用。尿液样本中共鉴定出25种差异代谢物，这有助于区分SPS组和HFD组。此外，烟酰胺N-氧化物、组胺、顺式乌头酸、柠檬酸、l-苹果酸、3-（3-羟基苯基）丙酸和N-乙酰-L-天冬氨酸对SPS抗2型糖尿病的作用至关重要，这些代谢物主要与能量代谢、肠道菌群和炎症有关。利用SPR在蛋白芯片上检测了Gal-3和FGF2与SPS组分的结合亲和力。SPS-F2和SPS-F3与Gal-3的结合亲和力较弱。3个组分均与FGF2结合，对FGF2的亲和力为SPS-F3＞SPS-F2＞SPS-F1。需要进一步的研究来揭示潜在的结合机制，以及SPS组分的先进结构和化学药物。
Characterization of squash polysaccharide and the anti-diabetic effect on type 2 diabetic rat revealed by urine metabolomics analysis
Li Lianga, Fuming Zhangb, Quanhong Lic,d, Baoguo Suna, Yuyu Zhanga,*, Robert J. Linhardtb,*
a Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048, China
b Departments of Chemical and Biological Engineering, Chemistry and Chemical Biology, Biomedical Engineering and Biological Science, Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy 12180, USA
c College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China
d China National Engineering Research Center for Fruit and Vegetable Processing, Beijing 100083, China
*Corresponding author.
Abstract
The present study reports the structural characteristics of 3 polysaccharide fractions (SPS-F1, SPS- F2 and SPS-F3) isolated and purified from squash. SPS-F1 (molecular weight (Mw) = 12.30 kDa) and SPS-F2 (Mw = 19.40 kDa) were likely to contain HG and RG-I domain of pectic polysaccharide, respectively. SPS-F2 (Mw = 270.4 kDa) was mainly composed of rhamnose, galactose and arabinose. The treatment with SPS decreased body weight gain, glucose and TG levels in type 2 diabetes rats. Besides, 25 differential metabolites were identified based on urinary metabolomics analysis, which are crucial to the anti-diabetic effect of SPS. The regulation of nicotinamide N-oxide, histamine, cis-aconitate, citrate, L-malic acid, 3-(3-hydroxyphenyl) propanoic acid and N-acetyl-L-aspartic acid were mainly associated with energy metabolism, gut microbiota and inflammation. Study of surface plasmon resonance revealed the binding kinetics with galectin-3 (Gal-3) and fibroblast growth factor 2 (FGF2). The KD values of SPS-F2 and SPS-F3 to Gal-3 were 4.97 × 10-3 and 1.48 × 10-3 mol/L, indicating a weak binding affinity. All 3 fractions showed moderate binding to FGF2 and the affinity was SPS-F3 > SPS-F2 > SPS-F1. Thus, the metabolomics and SPR approach were proved to be a promising tool in exploring the anti-diabetes effects of SPS and provided a deep understanding of the mechanisms.
Reference:
LIANG L, ZHANG F M, LI Q H, et al. Characterization of squash polysaccharide and the anti-diabetic effect on type 2 diabetic rat revealed by urine metabolomics analysis[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2937-2946. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250237.
翻译：王立磊（实习）
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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